Брзо и спонтано уклањање плазмодијум фалципарума после порођаја повезано је са избацивањем плаценте

Параситемијом код трудница са заштитним имунитетом на маларију Пласмодиум фалципарум често доминирају ВАР2ЦСА-позитивни инфицирани еритроцити (ИЕ). ВАР2ЦСА посредује секвестрацију ИЕ у плаценти. Претпоставили смо да је претходно уочено спонтано постпорођајно уклањање паразитемије код таквих жена повезано са избацивањем плаценте, што уклања фокус секвестрације ВАР2ЦСА-позитивних ИЕ. Процењивали смо паразитемије и транскрипцију гена пре и убрзо након порођаја код 17 жена из Гане. Нагли пад паразитемије после порођаја био је праћен селективним смањењем транскрипције гена који кодира ВАР2ЦСА. Наши налази пружају механичко објашњење за раније посматрање.

Кључне речи.

стечени имунитет; ВАР2ЦСА; пфЕМП1; плацентална маларија; Пласмодиум фалципарум; трудноћа; вар гени; варијантно-специфичан имунитет.

Становници подручја са стабилном трансмисијом паразита Пласмодиум фалципарум стичу значајан заштитни имунитет на маларију у детињству, рецензирано у референци [1]. Протеин 1 мембране еритроцита П. фалципарум (ПфЕМП1) је породица паразитских антигена, кодираних са приближно 60 вар гена по геному, који посредује у секвестрацији зрелих инфицираних еритроцита (ИЕ) до васкуларних рецептора домаћина, прегледано у референци [2]. Упркос важности ПфЕМП1 у стеченом заштитном имунитету, жене у таквим областима ипак постају веома подложне маларији током трудноће. Ово је повезано са инфекцијама паразитима који експримирају ПфЕМП1 типа ВАР2ЦСА, што доводи до акумулације ИЕ у интервилозном простору, изазивајући плацентну маларију [2, 3].

ВАР2ЦСА посредује адхезију ИЕ на ниско-сулфатни хондроитин сулфат (ЦСА), рецептор домаћина који је нормално ограничен на плаценту [4]. Рецепторно-специфична секвестрација ИЕ је важна стратегија преживљавања паразита, јер спречава уништавање зрелих ИЕ у слезини [2]. ВАР2ЦСА-позитивне ИЕ су стога у огромном недостатку преживљавања код домаћина који нису трудни, а ВАР2ЦСА-специфични имуноглобулин Г (ИгГ) се не добија пре прве трудноће [2, 3]. Ово објашњава високу подложност трудница (а посебно примигравидае) на маларију П. фалципарум, чак и у областима са стабилном трансмисијом паразита, где се значајан заштитни имунитет стиче много пре достизања репродуктивног доба [3]. Инфекцијама П. фалципарум код трудница заиста често доминирају паразити који експримирају ВАР2ЦСА [5], иако се често налазе и паразити који експримирају друге типове ПфЕМП1 (и који се вероватно секвестрирају изван плаценте) [6]. На основу тога предлажемо да се могу дефинисати 2 фундаментално различита типа маларије код трудница. Једна је плацентна маларија, коју изазивају паразити који експримирају ВАР2ЦСА и која се јавља углавном код жена ниског паритета без значајног ВАР2ЦСА-специфичног заштитног имунитета. Други тип је маларија узрокована паразитима који експримирају друге типове ПфЕМП1 и где се ИЕ секвестрирају у неплацентарним ткивима. Овај последњи тип није ограничен на труднице и може се јавити код жена било ког паритета. Он једноставно одражава празнине у варијантном (углавном ПфЕМП1) специфичном имунитету уопште [7].

Имајући ове тачке на уму, претпоставили смо да ранији извештаји о спонтаном решавању паразитемије П. фалципарум код трудница у Африци у року од неколико дана од порођаја [8, 9] одражавају изненадни нестанак фокуса секвестрације ВАР2ЦСА-позитивних ИЕ као постељица се избацује током порођаја.

МЕТОДЕ

Место проучавања и учесници

Студија је спроведена у 5 здравствених установа (Абура Дунква, Бирива, Манкессим, Морее и Салтпонд) у централном региону Гане. Пренос П. фалципарум у области истраживања је стабилан, али са значајним сезонским варијацијама.

Краткорочне труднице, које су писмено пристале да учествују у студији након што су добиле усмене и писмене информације о њеним циљевима, регрутоване су између новембра 2020. и фебруара 2021. Жене са било којим обликом компликација у трудноћи биле су искључене из учешћа. Иако је већина жена примала повремени превентивни третман као део тренутне политике пренаталне неге у Гани (додатна табела 1), ниједна од њих није примала било какав облик антималаријског лечења током трајања студије (тј. од непосредно пре порођаја до краја њихово учешће неколико дана касније). Студију је одобрио институционални одбор за преглед при Ногучи Меморијалном институту за медицинска истраживања (НМИМР-ИРБ ЦПН 005/20-21) и етички одбор за истраживање здравствене службе Гане (ГХС-ЕРЦ 005/08/20).

Детекција и квантификација инфекције П. фалципарум

Инфекција паразитима П. фалципарум одређена је брзим дијагностичким тестом, микроскопијом размаза крви обојених по Гиемси и квантитативном ланчаном реакцијом полимеразе (кПЦР) у суштини као што је претходно описано [10, 11], коришћењем прикупљених узорака периферне крви. ДНК екстрахована из шестоструких 10-разблажења ин витро културе П. фалципарум ИТ4 у стадијуму прстена са 1 процентом паразитемије коришћена је да се успостави стандардна крива која омогућава кПЦР квантификацију паразитемије.

Анализа транскрипције вар гена

Parasite RNA was preserved in the field and used for quantification of var gene transcript levels essentially as described [11, 12], but using universal 1-step reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) kits (E3005X, NEB Inc), a Quant Studio 5 thermal cycler system and fructose-bisphosphate aldolase as endogenous control. Data points were not considered if the cycle threshold (Ct) value for the endogenous control was >30 and/or if the Tm for the var gene amplicon for each pair of primers diverged >2 степена од очекиване вредности. Обиље транскрипта је израчунато коришћењем 2-ΔЦт, где је средња вредност ΔЦт=средња вредност пара прајмера Цтвар − средња вредност Цтендогене контроле.

Статистичка анализа

Повезаност између вар2цса транскрипције и клиничких варијабли тестирана је корелацијом Спеармановог ранга са корекцијом за вишеструко тестирање. Корелација између паразитемија откривених микроскопски и ПЦР-ом је процењена Пеарсоновим тестом корелације продукт-момент. Подаци добијени у различитим временским тачкама су упоређени анализом поновљених мерења варијансе (РМ-АНОВА) или РМ-АНОВА на ранговима (РМ-АНОВА-Р), према потреби, након чега је уследило пост хоц тестирање за разлике у пару. За анализу података и П вредности коришћен је софтвер СигмаПлот верзије 14 (Систат Инц).<.05 were considered significant.

РЕЗУЛТАТИ

Учесници студија

Укупно 377 жена које су дале пристанак прегледано је на инфекцију П. фалципарум током порођаја. Од тога, 15 (4.0 процента) је било позитивно на паразите микроскопијом периферног размаза крви убодом прста, 24 (6,4 процента) брзим дијагностичким тестом, а 50 (13,3 процента) ПЦР-ом. На основу ових резултата, 17 жена позитивних на брзи дијагностички тест је укључено и одабрано за праћење 8-16 сати након порођаја, 24-48 сати након порођаја и 48-72 сата након порођаја. Клиничке информације учесника студије су сажете у Додатној табели 1. Није било статистички значајне повезаности између удела паразита који транскрибују вар2цса и било које од наведених клиничких варијабли.

Постпартално уклањање паразитемије

У време порођаја, сви учесници студије су били паразитски на основу размаза крви и/или кПЦР (додатна табела 1). До 8 до 16 сати након порођаја, микроскопски уочљива паразитемија је спонтано опала (тј. без терапијске интервенције) код 14/17 жена (Слика 1А). До 24–48 сати након порођаја, паразитмије су додатно опале и биле су веома ниске или се нису могле детектовати код већине жена (П=.03 у поређењу са предпорођајем, Фриедман РМ-АНОВА-Р). Још 24 сата касније, све жене осим 1 биле су без уочљиве паразитемије (П=.005 у поређењу са предпорођајем, РМ-АНОВА-Р). С обзиром на паразитемије откривене ПЦР-ом (Слика 1Б), постпарталне паразитемије су биле значајно ниже за 24–48 сати и 48–72 сата од предпорођаја (П < .001, РМ-АНОВА-Р). Нивои су такође били значајно нижи 48–72 сата после порођаја него 8–16 сати после порођаја (П < .001, РМ-АНОВА-Р). Паразитемије процењене микроскопијом и кПЦР значајно су корелирале (П < .001). Ови подаци потврђују претходне извештаје о брзом и спонтаном постпорођајном уклањању паразитемије П. фалципарум код жена које живе у подручјима са стабилном трансмисијом овог паразита [8, 9].

Паразитска транскрипција вар гена

To identify the likely sequestration focus of the IEs detected, we measured parasite transcription of the PfEMP1-encoding var gene groups. Prior to delivery, var2csa, which encodes VAR2CSA-type PfEMP1 mediating placental IE sequestration [2, 3], was the primary transcript (up to >90 процената укупне вар транскрипције) код 9/17 жена и вар2цса транскрипција може се открити код свих (слика 2 и додатна слика 1). Транскрипција вар гена који нису повезани са плацентном маларијом је тако откривена (поред вар2цса) код свих учесника пре порођаја и доминирала је код неких жена, у складу са претходним запажањима [6].

Проценат вар2цса транскрипата се смањио током праћења након порођаја код свих жена (слика 2 и додатна слика 1), паралелно са смањењем паразитемија (слика 1). Стога је дошло до значајног померања од транскрипције вар2цса пре порођаја ка транскрипцији других вар гена након порођаја. Једини изузеци (међу оним женама код којих су били доступни подаци о транскрипцији након порођаја) биле су учеснице Б213, С003, С001 и Б201 (додатна слика 1). Међутим, на основу запажања да су постпорођајне паразитемије такође значајно опадале међу тим женама (Слика 1), сматрамо да је вероватно да би се одговарајући помак од транскрипције вар2цса видео да су подаци из каснијих временских тачака били доступни. Све у свему, подаци су у потпуности у складу са селективним нестанком ВАР2ЦСА-позитивних ИЕ као што смо претпоставили.

ДИСКУСИЈА

ПфЕМП1 је породица протеина коју интраеритроцитни паразити П. фалципарум извозе на површину ИЕ, где функционишу као адхезиони лиганди за различите васкуларне рецепторе домаћина [2]. Ови лиганди су кодирани фамилијом гена вар клонске варијанте са око 60 чланова по геному хаплоидног паразита. Гени се транскрибују и преводе на међусобно искључив начин, обезбеђујући да се само један ПфЕМП1 експресује на површини ИЕ у било ком тренутку. Међутим, сваки паразит има потенцијал да се пребаци између својих различитих вар гена, омогућавајући промене у специфичности адхезије ИЕ и антигенским својствима [2].

ПфЕМП1 протеини се могу груписати и подгруписати према скупу структурних критеријума, који утичу на њихове функционалне карактеристике [2]. Дакле, група А ПфЕМП1 (кодирана са десетак вар гена по геному) посредује у адхезији ИЕ на рецепторе домаћина као што су ЕПЦР и ИЦАМ-1, и умешани су у патогенезу тешке маларије у детињству уопште, и церебралне маларије посебно [2]. Насупрот томе, чини се да је транскрипција гена који припадају групи Б и Ц повезана са некомпликованом маларијом и асимптоматским инфекцијама. Коначно, ПфЕМП1 типа ВАР2ЦСА, кодиран са само једним или неколико вар2цса гена по геному паразита, функционално је и антигенски потпуно различит од свих осталих ПфЕМП1, и снажно је имплициран у патогенези, као и у стеченом имунитету на плацентни маларија [2, 3, 13].

Штавише, већина доступних доказа указује на ВАР2ЦСА као на главни и вероватно једини верни ЦСА лиганд. Коначно, раније је показано да периферна паразитемија код трудница са доживотном изложеношћу П. фалципарум укључује и често доминирају ИЕ који су ВАР2ЦСА-позитивни и имају општи карактеристичан фенотип плаценталне инфекције П. фалципарум [5, 13– 15]. На основу тога, претпоставили смо да је најкоментарније објашњење за спонтано уклањање паразитемије код трудница у року од неколико дана након порођаја [8, 9] селективно уништавање слезене ВАР2ЦСА-позитивних ИЕ након избацивања плаценте током порођаја, што ефикасно уклања њихов сродни адхезиони рецептор.

Овде представљени резултати потврђују раније објављено [8, 9] брзо постпорођајно уклањање периферне паразитемије П. фалципарум (Слика 1). Они даље подржавају запажања да периферна паразитемија код афричких трудница укључује и често доминирају паразити који транскрибују вар2- цса [6, 15] (слика 2 и додатна слика 1). Оно што је најважније, међутим, наши подаци проширују ова ранија запажања пружајући први пут убедљиве доказе за механичко објашњење за брзо уклањање периферних паразита након порођаја код жена са природно стеченим имунитетом на маларију П. фалципарум. Осим бројчано веома мале, и само гранично значајне, разлике у транскрипцији вар групе А1 (додатна слика 2), једина већа и статистички значајна промена у транскрипцији вар гена након порођаја била је смањена релативна транскрипција вар2цса (слика 2Б и допунски Слика 2).

Наша студија има ограничења. Величина узорка је мала. Ово је углавном зато што је успешна примена интермитентног превентивног лечења маларије код трудница, што је учинило плацентну маларију много мање распрострањеном и захтевало скрининг многих жена како би се пронашли подобни учесници. Штавише, ограничени капацитети на нашем месту истраживања спречили су директну процену специфичности адхезионих рецептора сакупљених ИЕ или њиховог имунолошког фенотипа. Ипак, тренутни докази и ранији налази се беспрекорно комбинују.

У закључку, представили смо доказе да нагли нестанак фокуса секвестрације ВАР2ЦСА-позитивних ИЕ када је плацента избачена значајно доприноси брзом и спонтаном постпорођајном уклањању паразитемије П. фалципарум код жена које су природно биле изложене овим паразитима. Паразити који транскрибују друге вар гене и приказују ПфЕМП1 не-ВАР2ЦСА типа на површини ИЕ често нису у стању да напредују и изазивају болест код одраслих у ендемским областима, због заштитног ПфЕМП1-специфичног имунитета на маларију стеченог у детињству [2] . Континуирано преживљавање не-ВАР2ЦСА ИЕ после порођаја може бити додатно угрожено физиолошким процесима повезаним са порођајем, као што су проинфламаторни имуни одговори. Коначно, неоткривени унос антималаријских лекова непосредно пре порођаја могао би да допринесе. Шта год да је разлог, паразитемија је значајно опала након порођаја код неких жена, где су паразити који транскрибују вар2цса чинили само мањину паразитемије пред порођајем, и овај налаз заслужује даље проучавање. Наша студија подупире кључну улогу ПфЕМП1 у стеченом имунитету на маларију уопште, а посебно ВАР2ЦСА у патогенези и имунитету плацентне маларије.

Додатни подаци

Додатни материјали су доступни у Тхе Јоурнал оф Инфецтиоус Дисеасес на мрежи. Састојећи се од података које су аутори дали у корист читаоца, објављени материјали се не копирају и искључиво су одговорност аутора, тако да питања или коментаре треба упутити аутору који одговара.

Напомене

Прилози аутора.

НГА, МПК, МФО и ЛХ допринели су концепцији и дизајну студије. НГА је извршио прикупљање узорака. НГА, МПК и ЛХ су извршили анализу података. НГА, МПК и ЛХ су припремили рукопис. Сви аутори су прочитали и одобрили коначну верзију рукописа.

Признања.

Захвални смо свим женама које су пристале да учествују у нашој студији. Такође се захваљујемо свим бабицама, лекарима, помоћницима лекара и медицинским сестрама у различитим здравственим установама на помоћи у прикупљању узорака.

Одрицање од одговорности.

Финансери нису имали никакву улогу у дизајну студије, прикупљању и анализи података, одлуци о објављивању или припреми рукописа. Финансијска средства за плаћање трошкова публикације отвореног приступа за овај чланак обезбедила је Данида.

Финансијска подршка.

Овај рад је подржала Данида (грант број 17-02-КУ за МАВАРЕЦА-ИИ пројекат), укључујући докторат на НГА Извршна истраживачка агенција Европске комисије подржала је МПК (број гранта 101028915, Марие Скłодовска-Цурие Индивидуал Фелловсхип 2020. , ПАМСЕК пројекат).

Потенцијални сукоби интереса.

Сви аутори: Нема пријављених сукоба интереса. Сви аутори су предали ИЦМЈЕ образац за откривање потенцијалног сукоба интереса. Откривени су сукоби које уредници сматрају релевантним за садржај рукописа.

Референце