Укупни гликозиди и полисахариди Цистанцхе Десертицола спречавају остеопорозу

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Фујианг Ванг 1, Пенгфеи Ту, Кеву Зенг *, Ионг Јианг **

АПСТРАКТАН

Етнофармаколошка релевантност:Традиционална кинеска медицина Цистанцхе десертицола ИЦ Ма има ефекат "тонизирања бубрега и јачања костију". Међутим, специфични активни екстракти Ц. десертицола и механизми за лечење остеопорозе нису јасни.

Циљ студије:Желели смо да идентификујемо ефикасне компоненте екстракта Ц. десертицола за лечење остеопорозе и потенцијалне механизме.

Материјали и методе:Наша група је истраживала екстракте Ц. десертицола са анти-остеопоротичном активношћу, укључујући укупне гликозиде (ТГ), полисахариде (ПС) и олигосахариде (ОС) код мишева 6 (САМП6) склоних убрзаном старењу. Голднеров трихром, Ван Гиесонов (ВГ), Сафранин О-Фаст Греен бојење и бојење вон Косса су урађени да би се истражила формирање структуре костију и депозити калцијума. Серум је сакупљен за детекцију биохемијских маркера. Микро-архитектура кости је откривена микро-ЦТ. Експресије коштаног морфогенетског протеина-2 (БМП-2), остеокалцина (ОЦН), остеопротегерина (ОПГ), рецептор активатора нуклеарног фактора-κ Б лиганда (РАНКЛ), п-гликоген синтетазе киназе{{11 }} (п-ГСК-3), и п- -катенин су анализирани вестерн блотингом и имунохистохемијом.

Резултати:ТГ и ПС су побољшали хистопатолошка оштећења костију, промовисали формирање нових костију, колагених влакана и хондроцита и убрзали депозите калцијума. Штавише, они су значајно променили биомаркере коштаног обрта и ефикасно побољшали микроархитектуру костију. Даља студија механизама је показала да ТГ и ПС значајно смањују експресију РАНКЛ, п- -катенина, као и појачавају експресију БМП-2, ОЦН, ОПГ и п-ГСК{{ 4}} (Сер9).

Закључак:Налази ове студије сугеришу да ТГ и ПС могу да промовишу формирање остеокластогене кости и побољшају оштећење микроструктуре кости код САМП6 мишева, а њихов терапеутски ефекат на остеопорозу је преко активирања Внт/-катенин сигналног пута.

Цистанцхе можепромовишу остеокластогену костформирање и усавршавањеоштећење микроструктуре костију.

1. Представљање

Остеопороза је честа болест код старијих особа која озбиљно угрожава здравље човечанства (Ие ет ал., 2020). Пацијенти са остеопорозом могу бити потпуно асимптоматски пре прелома, тако да су ефикасна превенција и лечење остеопорозе најважнији (Телла и Галлагхер, 2014).

Истраживања показују да повећање ресорпције костију и смањење формирања костију доводе до неравнотеже у ремоделирању костију, што доводи до остеопорозе (Симс и Гоои, 2008). Остеобласти и остеокласти су две врсте ћелија које су критичне за формирање и ресорпцију костију. Пут внт/-цатенин је неопходан за раст, развој и одржавање коштаног ткива (Цадиган и Нуссе, 1997), а такође игра кључну улогу у регулисању диференцијације стромалних ћелија коштане сржи паса беагле (БМСЦ) (Јинг ет ал. , 2018). ГСК-3 спречава разградњу -катенина. -Катенин након тога улази у језгро, а затим се може повезати са фактором везивања Т-ћелија/лимфоидним појачивачем и регулише експресију циљних гена Внт. У међувремену, откривено је да Внт/-катенин сигнализација смањује диференцијацију остеокласта стимулишући производњу и лучење ОПГ (Гласс ет ал., 2005), који је природни антагонист РАНКЛ (Лацеи ет ал., 1998). ОПГ игра важну регулаторну улогу у формирању костију и ресорпцији костију. У сваком случају, брисање -катенина у остеокластима повећава број остеокласта и ресорпцију костију и смањује коштану масу (Веи ет ал., 2011). Инхибитори ресорпције костију и промотери формирања костију се углавном користе у лечењу остеопорозе. С обзиром да су очигледне и нежељене реакције тренутно коришћених лекова са тачном ефикасношћу, хитно је тражити лекове са мање нежељених ефеката.

Цистанцхе десертицола ИЦ Ма (Ц. десертицола) је једна од изворних биљака широко коришћене тоник традиционалне кинеске лековите биљке Цистанцхес Херба, Роуцонгронг на кинеском, за лечење неколико болести, као што су недостатак бубрега, женска неплодност и сенилна констипација за више од 1000 година у Кини (Национални комитет фармакопеје, 2020). Према теоријама традиционалне кинеске медицине (ТЦМ), "кости које доминирају бубрезима" и "кости које јачају бубреге", Ц. десертицола се користила за лечење остеопорозе. Студије су показале да Ц. десертицола може да побољша нивое алкалне фосфатазе (АЛП), остеокалцина и јона калцијума у ​​серуму, промовише експресију БМП-2 у остеобластима пацова (Ганг ет ал., 2018). Поред тога, студије су показале да Ц. десертицола има заштитне ефекте против остеокластогенезе изазване РАНКЛ (Зханг ет ал., 2019). Иако Ц. десертицола има терапеутски ефекат на остеопорозу, његове специфичне активне компоненте нису сасвим јасне. Од великог је значаја истражити ефикасне типове компоненти Ц. десертицола за лечење остеопорозе и сродних механизама.

Због тога смо спровели ову студију да бисмо утврдили да ли постоје неки корисни ефекти екстраката који садрже различите врсте хемијских састојака из Ц. десертицола на САМП6 мишеве. Резултати налаза могу дати тачне смернице за клиничку примену Ц. десертицола, као и открити материјалну основу Ц. десертицола за лечење остеопорозе.

2. Материјал и методе

2.1. Хемикалије и реагенси

Цистанцхе десертицола ИЦ Ма је купљен од Мандела Биотецхнологи Цо., Лтд (Аласхан, Унутрашња Монголија, Кина), а затим их је једна особа од аутора идентификовала (ПФ Ту). ТГ, ПС и ОС су припремљени према претходно поменутом методу (Гао ет ал., 2015). Анализа састава сваког екстракта је обављена коришћењем ХПЛЦ према извештају. (Ли ет ал., 2019; Ванг ет ал., 2020). Х&Е, Голднерово трихромно бојење, Ван Гиесоново (ВГ) бојење и Сафранин О-Фаст Греен комплети су купљени од Бостера (Хубеи, Кина). Зечји анти-миш БМП-2 (аб14933), ОЦН (аб93876), ОПГ (аб183910) и РАНКЛ (аб216484) су купљени од Абцам-а (Кембриџ, Британија). Технологија ћелијске сигнализације је била извор п-ГСК-3 против миша зеца (Сер9) (#5558), ГСК3 (#12456), -цатенин (#13727) и п- -цатенин (# 4176). Секундарна антитела су купљена од Зхонгсхан Голден Бридге Биотецхнологи (Пекинг, Кина).

Екстракт цистанцхе високог квалитетаизЦхенгду Вецистанцхе Био-Тецх Цо., Лтд

2.2. Животиње

5-месечне женке миша са убрзаним старењем/резистентним 1 (САМР1) и САМП6 мишева добијени су од Витал Ривер Лаборатори Анимал Тецхнологи (Пекинг, Кина). Све манипулације животињама су обављене у складу са смерницама које је издао Комитет за институционалну негу и употребу животиња Пекиншког универзитета.

2.3. Примене лека

Мишеви су насумично подељени у следећих пет група: САМР1 група (нормални физиолошки раствор, н=10); САМП6 група (нормални физиолошки раствор, н =10); ТГс група (400 мг/кг, н=10); Група ПС (400 мг/кг, н=10) и група ОС (400 мг/кг, н=10) (Гао ет ал., 2015). Сви лекови су давани иг и дневно током 12 недеља.

2.4. Голднеров трихром бојење, Х&Е бојење, СафранинО-Фаст Греен бојење и Ван Гиесоново (ВГ) бојење

После 12 недеља, бутне кости су брзо уклоњене и фиксиране коришћењем 10 процената етилен диамин тетрасирћетне киселине (ЕДТА) током 7 дана на 4 ◦Ц. Затим су бутне кости исечене на кришке (5 μм) и обојене Голднер Трицхроме, Ван Гиесон (ВГ), СафранинО-Фаст Греен и Х&Е бојењем према упутствима произвођача. Слике су посматране светлосним микроскопом (Леица, Солмс, Немачка).

2.5. Мерење нивоа БГП, БАЛП, П1НП, ПИЦП, АЛП, С-ЦТКС, ТРАЦП, У-ЦТКС, У-НТКС, Д-Пир и Пир

Концентрације коштаног гла протеина (БГП), алкалне фосфатазе специфичне за кост (БАЛП), Н-терминалног пропептида проколагена типа 1 (П1НП), Ц-терминалног пропептида проколагена типа И (ПИЦП), алкалне фосфатазе (АЛП), С–Ц -телопептид колагена типа И (С-ЦТКС), кисела фосфатаза отпорна на татрате (ТРАЦП), У-Ц-телопептид колагена типа И (У-ЦТКС), У-Н-телопептид типа И- колаген (У-НТКС), Д-пиридинолин (Д-Пир) и пиридинолин (Пир) одређени су ензимским имуносорбентним тестом (Јиангсу Меимиан Индустриал Цо., Лтд, Јиангсу, Кина).

2.6. Фон Косса бојење

Кришке бутне кости су потопљене у 1 процентни сребров нитрат на 30 мин под интензивним сунчевим зрацима и затим три пута испране дејонизованом водом. Потом је додат 5 процената натријум тиосулфата током 5 минута да би се уклонило неизреаговано сребро. Соли калцијум фосфата су визуализоване као црно бојење. За квантитативну анализу садржаја калцијума у ​​бутној кости примењен је софтвер Имаге-Про Плус верзија 6.0 и Адобе Пхотосхоп.

2.7. Анализа микро-компјутерском томографијом

Сви узорци фемура су скенирани у резолуцији од 9 μм микро-ЦТ скенером (ПеркинЕлмер, МА, САД). Даља анализа је обављена коришћењем софтвера Анализе12.0 за израчунавање минералне густине кости (БМД), запремине кости/укупне запремине (БВ/ТВ), трабекуларног броја (Тб. Н), трабекуларне сепарације (Тб. Сп), трабекуларна дебљина (Тб. Тх), и минерална густина ткива (ТМД). Тродимензионалне слике су реконструисане коришћењем софтвера ЦТВок (ПеркинЕлмер, МА, САД).

2.8. Акумулација тетрациклина и калцеина

Свакој животињи је интраперитонеално дато 25 мг/кг тетрациклина и 5 мг/кг калцеина 13. дана и 3. дана пре еутаназије, респективно. Акумулација тетрациклина и калцеина је испитана коришћењем Вецтра® Поларис™ аутоматизованог квантитативног система за сликање патологије (ПеркинЕлмер, МА, САД). Удаљеност између тетрациклина и калцеина може да се посматра помоћу софтвера Имаге-Про Плус верзије 6.0.

2.9. Вестерн блоттинг анализа

Ткива фемура су хомогенизована и лизирана у РИПА пуферу за лизу. Концентрација протеина је одређена коришћењем комплета реагенса за анализу протеина бицинхонинске киселине (БЦА) (Беијинг ТрансГен Биотецх, Пекинг, Кина). Укупни протеини су напуњени на 10 процената или 12 процената СДС-ПАГЕ гелова и затим пребачени на нитроцелулозну мембрану. Мембрана је блокирана и затим инкубирана преко ноћи са примарним антителима и ГАПДХ (Лос Анђелес, САД) на 4 ◦Ц, након чега је уследила инкубација са секундарним антителом. Траке анализе протеина су анализиране коришћењем Танон 5200 Мулти (Шангај, Кина).

2.10. Имунохистохемијска анализа

Секције ткива фемура су инкубиране са примарним антителима на 4 ◦Ц. Поликлонска антитела против БМП-2, ОЦН, ОПГ и РАНКЛ су разблажена на 1:200 и 1:100, респективно. Секундарна антитела миша против зечјег ИгГ (1:200) на 37 ◦Ц током 1 х. Коришћење Вецтра® Поларис™ аутоматизованог система квантитативне патологије (ПеркинЕлмер, МА, САД). За квантитативну анализу експресије протеина примењен је софтвер Имаге-Про Плус верзија 6.0 и Адобе Пхотосхоп.

2.11. Статистичка анализа

Резултати су изражени као средња вредност ± стандардна девијација. Једносмерна АНОВА је изведена приликом поређења различитих група. СПСС софтвер верзија 22.0 је коришћен за статистичку анализу, а П < 0.05="" се="" сматра="" статистички="">

цистанцхе реддит

3. Резултати

3.1. ТГ и ПС побољшавају хистопатолошка оштећења костију и промовишу формирање колагених влакана и хондроцита код САМП6 мишева

Патолошко оштећење бутне кости може се уочити Х&Е бојењем. Хистоморфолошке структуре кости у САМР1 групи су распоређене редовно. Међутим, горе поменуте структуре костију су оштећене у САМП6 групи. Морфолошке промене у групама ТГ и ПС биле су мање од оних у групи САМП6. Међутим, група за лечење ОС није показала значајно побољшање морфолошких промена (слика 1А). Урађено је Голднеров трихром, Ван Гиесон (ВГ) и Сафранин О Фаст Греен бојење да би се открило формирање структуре кости. Резултати су показали да су нове кости, колагена влакна и хондроцити у ТГ и ПС групама побољшани у поређењу са групом САМП6. Међутим, група за лечење ОС није показала значајно побољшање промена структуре кости (Слика 1Б-Д).

Слика 1. ТГ и ПС побољшавају хистопатолошка оштећења код САМП6 мишева.

3.2. ТГ и ПС мењају биомаркере коштаног обрта код САМП6 мишева

Када се појави остеопороза, нивои биомаркера формирања костију ће бити значајно смањени, као што су серумски БГП и ПИЦП. Насупрот томе, нивои биомаркера који су повезани са ресорпцијом кости су били значајно повећани, укључујући серумски ТРАЦП и С-ЦТКС (слика 2). Охрабрујуће, групе ТГ и ПС су могле да преокрену нивое БГП, БАЛП, П1НП, ПИЦП, АЛП, С-ЦТКС, ТРАЦП, У-ЦТКС, У-НТКС, Д-Пир и Пир, али ОС не могу.

Слика 2. Ефекти ТГ и ПС на биомаркере коштаног обрта код САМП6 мишева.

3.3. ТГ и ПС промовишу формирање нове кости и депозит калцијума код САМП6 мишева

Да би се тестирало да ли се формирање костију и таложење фосфатних минерала може подстаћи третманом ТГ, ПС и ОС, обављено је обележавање тетрациклином калцеином и Вон Косса бојење. Резултати су показали да је формирање нове кости код САМП6 мишева значајно ниже него код САМР1 мишева, док су ТГ и ПС значајно промовисали формирање нове кости (слика 3А). Фон Коса бојење је открило да је доста калцијума депоновано у групама за третман ТГ и ПС (Слика 3Б).

Слика 3. ТГ и ПС промовишу формирање нове кости и таложење минерала код САМП6 мишева.

3.4. ТГ и ПС побољшавају микроархитектуру костију код САМП6 мишева

Микро-архитектура кости је откривена микро-ЦТ. У поређењу са САМР1 мишевима, САМП6 мишеви су имали погоршану микроархитектуру, док је стање костију код мишева лечених ТГ и ПС током 12 недеља било побољшано (слика 4). Такође смо открили да су индекси БМД, БВ/ТВ, Тб.Н и Тб. Тх су смањени и индекси Тб. Сп и ТМД су повећани код САМП6 мишева, у поређењу са онима код САМР1 мишева. ТГ и ПС су значајно повећали БМД, БВ/ТВ, Тб. Н, Тб. Тх и смањен Тб. Сп и ТМД у поређењу са САМП6 мишевима. Међутим, нису примећене никакве значајне промене у групи ОС.

3.5. ТГ и ПС мењају БМП-2, ОЦН, ОПГ и РАНКЛ изразе код САМП6 мишева

Испитали смо експресије протеина БМП-2, ОЦН, ОПГ и РАНКЛ. ТГ и ПС изазвали су изузетну регулацију БМП-2, ОЦН и ОПГ, док је експресија РАНКЛ смањена (слика 5). Међутим, није било значајне разлике у групи која је примала ОС.

Слика 4. Ефекти ТГ и ПС на минералну густину костију и микроархитектуру костију.

3.6. ТГ и ПС мењају експресије п-ГСК-3 (Сер9) и п- -катенина код САМП6 мишева

Да би се разумели механизми ТГ и ПС који подстичу остеобластогенезу, експресије п-ГСК-3 (Сер9) и п- -катенина у коштаном ткиву САМП6 мишева мерене су применом Вестерн блотинга (слика 6). Резултати су показали да третмани ТГс и ПСс значајно побољшавају експресију п-ГСК-3 (Сер9) и смањују експресију п- -катенина у бутној кости у поређењу са групом САМП6. Међутим, група за лечење ОС није показала значајну промену.

4. Дискусија

У тренутном раду користимо САМП6 и САМР1 мишеве за проналажење ефикасних компоненти из Ц. десертицола против остеопорозе. За процену терапијских ефеката, као и могућих механизама, коришћена су три екстракта из Ц. десертицола. Поред тога, анализирани су и експресије РАНКЛ, ОПГ, ОЦН и БМП-2 као и других регулатора ресорпције костију. У поређењу са групом САМП6, ТГ и ПС могу побољшати хистопатолошко оштећење костију, као и промовисати формирање нове кости, колагених влакана, хондроцита и таложења калцијума. У међувремену, оба могу да промене биомаркере коштаног промета и ефикасно побољшају микроструктуру костију. Међутим, нису примећени заштитни ефекти за лечење ОС.

Слика 5. ТГ и ПС промовишу експресије БМП-2, ОЦН и ОПГ и смањују експресију РАНКЛ.

ТЦМ се интензивно користе за ублажавање симптома многих болести као што је остеопороза. ублажавају различите симптоме болести укључујући остеопорозу. Бројна анти-остеопоротична биоактивна једињења су идентификована из десетина природних кинеских лековитих биљака које се обично користе за тонирање бубрега, као и за очување есенције бубрега (Ксу ет ал., 2017; Лиу ет ал., 2018). Ц. десертицола поседује релативно високу безбедност и широк спектар терапијских функција за лечење бубрежне инсуфицијенције. Многе истраживачке студије откриле су терапеутске ефекте екстраката Ц. десертицола на остеопорозу (Ли ет ал., 2012; Лианг ет ал., 2013; Сонг ет ал., 2018).

Остеобласти који формирају кости и остеокласти који ресорбују кост, који су настали из диференцијације мултипотенцијалних мезенхималних матичних ћелија (МСЦ), су терминално диференциране ћелије са кратким животом (Теителбаум и Росс, 2003). Обе се морају континуирано замењивати новима који потичу од матичних ћелија (Лонг, 2011). Внт/-катенин сигнални пут, који игра виталну улогу у диференцијацији коштаног ткива, стимулише производњу остеобласта промовишући оријентацију и диференцијацију мултипотенцијалних МСЦ у остеобласте (Родда и МцМахон, 2006). Поред тога, Внтс спречавају апоптозу зрелих остеобласта и на тај начин продужавају њихов животни век путем оба -катенин зависних и независних путева (Алмеида ет ал., 2005). Према томе, сигнални пут Внт/-катенина игра важну улогу у разјашњавању патогенезе остеопорозе. У овом експерименту, САМП6 мишеви су коришћени за испитивање ефикасности анти-остеопоротичких средстава из различитих екстраката Ц. десертицола. ТГ и ПС су значајно смањили нивое РАНКЛ и п- -катенина и повећали изразе БМП-2, ОЦН, ОПГ и п-ГСК-3. Укратко, терапеутски ефекат ТГс и ПСс на САМП6 мишеве био је углавном кроз активирање Внт/-цатенин сигналног пута.

Пошто је прекомерна апсорпција остеокласта важан узрок остеопорозе, фактори повезани са активацијом и диференцијацијом остеокласта могу се сматрати важним циљевима за спречавање губитка коштане масе (Такатсуна ет ал., 2005). У нашој студији, експресија РАНКЛ-а је била значајно смањена, у исто време ниво ОПГ-а је могао бити регулисан навише ТГ-овима и ПС-има. Добро је документовано да процес формирања костију и ремоделирања диференцијације ћелија остеобласта карактерише углавном повећана експресија БМП-2 и ОПН (Цаналис, 2009). У овој студији смо открили да ТГ и ПС Ц. десертицола повећавају експресију БМП-2 и ОПГ-а и побољшавају минерализацију костију. Према томе, ТГ и ПС посредују у формирању костију тако што регулишу БМП-2 и ОПН и смањују РАНКЛ.

Маркери формирања костију одражавају активност ћелија за изградњу костију, исти маркери ресорпције костију одражавају активност остеокласта. Микроархитектура се погоршава као резултат измењених маркера коштаног обрта. У нашој студији, маркери ресорпције кости (С-ЦТКС, ТРАЦП, У-ЦТКС, Д-Пир, У-НТКС, Пир) су значајно смањени у групама ТГс и ПСс, а обрнуто, маркери формирања кости (БГП, БАЛП , П1НП, ПИЦП, АЛП) значајно се повећавају. Отуда се може видети да ТГ и ПС Ц. десертицола промовишу реконструкцију остеопоротичне кости.

Внт/ -цатенин пут стимулише експресију маркера диференцијације остеобласта и минерализације, истовремено активира експресију главног остеогеног фактора БМП-2 у остеобластима (Зханг ет ал., 2013). Поред тога, -катенин повећава експресију ОПГ-а у остеобласту, који индиректно потискује диференцијацију остеокласта инхибирајући ресорпцију кости (Барон и Кнеиссел, 2013). Наша садашња студија показује да ТГ и ПС значајно повећавају регулацију п-ГСК-3 и смањују ниво п- -катенина. Ови резултати подржавају закључак да је функција ТГ и ПС на анти-остеопоротицима регулисана активацијом Внт/-катенин сигналног пута.

Наша претходна ХПЛЦ анализа показала је да су пет фенилетаноидних гликозида укључујући ехинакозид, цистанозид А, актеозид, изоактеозид и 2′-ацетилактеозид биле главне компоненте у ТГ (Ли ет ал., 2019; Схи ет ал., 2019). Структуре горњих пет фенилетаноидних гликозида су биле богате фенолним хидроксилним групама, које су одговорне за антиоксидативна својства Ц. десертицола (Цхен ет ал., 2016). Пријављено је да побољшање антиоксидативног система може спречити губитак коштане масе, тако да ови фенилетаноидни гликозиди могу бити потенцијалне активне компоненте Ц. десертицола одговорне за анти-остеопоротску активност. Постоје извештаји да ехинакозид и актеозид могу да побољшају типичне патолошке карактеристике остеопорозе, као што су побољшање квалитета костију и укупне БМД бутне кости, подстицање формирања костију и инхибиција ресорпције кости (Цхен ет ал., 2020). Поред тога, ехинакозид има упечатљив анти-остеопоротски ефекат (Ли ет ал., 2013). Претходне студије су показале да цистанозид А може да подстакне формирање костију и спречи ресорпцију кости кроз инхибицију НФ-κБ и активирање ПИ3К/Акт путева (Ксу ет ал., 2017). Анти-остеопоротски ефекат полисахарида Ц. десертицола није пријављен. Међутим, друге студије су показале да полисахариди астрагалуса могу потиснути експресију РАНКЛ-а, повећати ниво ОПГ-а у серуму и коначно блокирати диференцијацију остеокласта (Хуо и Сун, 2016; Хванг ет ал., 2018). ОС Ц. десертицола се углавном састоје од манитола, бетаина, фруктозе, глукозе и сахарозе (Схи ет ал., 2019), за које нема извештаја о анти-остеопоротској активности, стога ОС немају терапеутски ефекат на остеопорозу. Укратко, ТГ и ПС су активне компоненте у Ц. десертицола за ефекат анти-остеопорозе.

Цистанцхе херба суплементи у прахуима анефекат против остеопорозе.

За више информација кликните овде.

5. Закључци

У закључку, ТГ и ПС из Ц. десертицола могу побољшати формирање костију код САМП6 мишева кроз регулисање Внт/-цатенин сигналног пута, али не и ОС. У будућности, ТГ и ПС могу постати обећавајући терапеутски агенси за заштиту костију за остеопорозу.