Укупни гликозиди из стабљика Цистанцхе Тубулоса ублажавају понашање налик депресији: Двосмерна интеракција фитокемикалија и цревне микробиоте

за више информација:ali.ma@wecistanche.com

Ли Фан, ет ал

АПСТРАКТАН

Позадина: Као најчешће коришћена биљка за тонирање бубрега-јанг у традиционалној кинеској медицини, осушене сочне стабљикеЦистанцхетубулоса(Сцхенк) Вигхт (ЦТ) се показао ефикасним у лечењу депресије. Међутим, компоненте антидепресива и њихов основни механизам остају нејасни.

Сврха: Да истражите активне компоненте ЦТ-а(Цистанцхетубулоза)против депресије, као и потенцијалних механизама. Дизајн студије и методе: Тестови очаја у понашању су коришћени за процену антидепресивне активности полисахарида, олигосахарида и различитих фракција обогаћених гликозидима одвојених од ЦТ, као и типичних метаболита цревне микробиоте укључујући 3-хидроксифенилпропионску киселину ({{2 }}ХПП) и хидрокситиросол (ХТ). Штавише, ефекти биоактивних фракција и метаболита на моделе хроничног непредвидивог благог стреса (ЦУМС) су истражени уз помоћ вишеструких фармакодинамичких и биохемијских анализа. Промене у хистологији дебелог црева и цревној баријери уочене су бојењем и имунохистохемијском анализом. Карактеристике цревних микроба и метаболизам триптофан-кинуренина истражени су коришћењем секвенцирања 16С рРНА и вестерн-блотинга.

Резултати: Укупногликозиди(ТГ) је драматично ублажила понашања налик депресији у поређењу са различитим одвојеним фракцијама, одражавајући се у синергистичким ефектима фенилетаноидних и иридоидних гликозида на хиперактивацију хипоталамус-хипофизно-надбубрежне (ХПА) осе, тешке неуро- и периферне упале и недостатке у 5-хидрокситриптамину (5-ХТ) и неуротрофном фактору који потиче из мозга у хипокампусу. Штавише, ТГ(укупни гликозиди)ублажио упалу ниског степена у дебелом цреву и поремећај цревне баријере, а обиље неколико бактеријских родова је у високој корелацији са ХПА осом и упалом код ЦУМС пацова. Конзистентно, експресија индолеамина 2, 3-диоксигеназе 1 (ИДО1) у дебелом цреву је значајно смањена након ТГ(укупни гликозиди)администрација, праћена супресијом метаболизма триптофан-кинуренина. С друге стране, ХТ је такође показао изражен антидепресивни ефекат побољшањем функције ХПА осе, проинфламаторног ослобађања цитокина и метаболизма триптофан-кинуренина, док није био у стању да у великој мери прилагоди поремећену микробиоту црева на исти начин као ТГ. Изненађујуће, супериорнији од флуоксетина, ТГ и ХТ могу додатно побољшати дисфункцију хипоталамус-хипофизно-гонадне осе и абнормални метаболизам цикличних нуклеотида.

Кључне речи: Цистанцхетубулоса, укупни гликозиди, хидрокситиросол, депресија, цревна микробиота

Цлицк то цистанцхе десертицола ма продуцт

Увод

Депресија је хронични, понављајући и потенцијално по живот опасан ментални поремећај који погађа до 20 процената популације широм света (Набави ет ал., 2017). Тренутно, иако су бројни антидепресиви одобрени, нежељени ефекти су забрињавајући. Значајно је да је дуготрајно лечење селективним инхибиторима поновног преузимања серотонина (ССРИ) као што је флуоксетин, главни фармаколошки агенс за депресију, погоршало проблеме као што је хронична сексуална дисфункција (Бијлсма ет ал., 2014); ово је привукло све већу пажњу на откриће нових антидепресива из природних биљака (Ванг ет ал., 2019). У теорији традиционалне кинеске медицине (ТЦМ), недостатак бубрега-јанга доводи до карактеристика перформанси сличних клиничким симптомима депресије, као што су осећај да сте у сметлиштима, губитак интересовања и сентименталност (Ианг ет ал., 2020), промовишући мисли за ублажавање понашања налик депресији тонизацијом бубрега-јанга. Случајно, многе биљке које тонификују бубреге и јанг имају предност у побољшању сексуалне функције (Ву ет ал., 2015). Такве студије нас терају да обратимо пажњу на потенцијалну применуЦистанцхесХерба, која је најчешће коришћена биљка за тонирање бубрега и јанга у ТКМ-у и ефикасна је у лечењу мушке сексуалне дисфункције (Ванг ет ал., 2020), у смислу развоја антидепресива.ЦистанцхесХерба, званично забележено као осушене сочне стабљикеЦистанцхетубулоса(Шренк) Вајт (ЦТ) иЦистанцхедесертицола(ИЦ Ма) у кинеској фармакопеји (Ванг ет ал., 2017), користи се у Кини и другим земљама источне Азије од 15. века за лечење стања као што су недостатак бубрега-јанга, импотенција и неплодност код жена. Савремене фармаколошке студије указују на тоЦистанцхесХерба има вишеструку биоактивност, као што су јачање имунитета, неуропротекција, антиоксидативни ефекти, ефекти против старења и умора (Ванг ет ал., 2017). Неуропротективна својстваЦистанцхесХерба сугерише њен терапеутски потенцијал код когнитивних болести као што су мождани удар, депресија и Алцхајмерова болест (Ванг ет ал., 2020). У нашој претходној студији открили смо да ЦТ(Цистанцхетубулоза)екстракт је ублажио понашање налик депресији пацова хроничног непредвидивог благог стреса (ЦУМС) (Ли ет ал., 2018). До данас, хемијска анализа ЦТ(Цистанцхетубулоза)показало је да његови главни састави укључују фенилетаноидне гликозиде, иридоидне гликозиде, полисахариде и олигосахариде (Јианг и Ту, 2009), међутим, врста једињења која игра доминантну улогу у његовом антидепресивном ефекту остаје нејасна.

Бројне студије су потврдиле да физиолошко деловање црева (посебно комензалне микробиоте) игра важну улогу у развоју депресије и може да регулише неуроендокрини, аутономни нервни систем и имуни систем (Ианг ет ал., 2020). Штавише, однос који повезује метаболизам триптофана, микробиоту црева и депресију постепено је привукао велику пажњу. Измењена микробиота црева може активирати пут триптофан-кинуренин, што последично смањује периферну и церебралну доступност триптофана, што резултира недостатком 5-ХТ (Агус ет ал., 2018). Наша претходна студија је показала да фенилетаноидни гликозиди у ЦТ(Цистанцхетубулоза)генерално показују ниску биодоступност и могу се брзо метаболисати у 3-хидроксифенилпропионску киселину (3-ХПП) и хидрокситиросол (ХТ) микробиотом црева (Ли ет ал., 2016). Поред тога, ЦТ(Цистанцхетубулоза)Извештава се да екстракт обнавља хомеостазу цревне микробиоте код ЦУМС пацова (Ли ет ал., 2018). На основу таквог истраживања, закључили смо да би двосмерна интеракција фитокемикалија и цревне микробиоте могла да управља антидепресивним ефектима специфичних биоактивних компоненти ЦТ-а.(Цистанцхетубулоза). Конкретно, једињења могу да се трансформишу у метаболите који се могу апсорбовати (као што су 3-ХПП и ХТ) у гастроинтестиналном тракту помоћу цревне микробиоте, а затим испољити антидепресивне ефекте. Заузврат, структурне промене цревне микробиоте изазване биоактивним компонентама могу истовремено играти виталну улогу у активности антидепресива.

Овде смо у нашој студији користили тестове очаја у понашању да проценимо антидепресивне активности полисахарида, олигосахарида и различитих фракција обогаћених гликозидима одвојених од ЦТ(Цистанцхетубулоза)водени екстракт (ЦТЕ) и типичне метаболите цревне микробиоте (укључујући 3-ХПП и ХТ), што смо даље потврдили у моделу хроничног непредвидивог благог стреса (ЦУМС) са вишеструким фармакодинамичким и биохемијским анализама. Након тога, истражили смо да ли је његов механизам против депресије релевантан за двосмерну интеракцију фитокемикалија и микробиоте црева.

Материјали и методе

Материјали

Сви стандарди који се користе за хемијску анализу су купљени од Дурста (Сицхуан, Кина). 3-ХПП, ХТ, флуоксетин и имипрамин су купљени од Аладина (Шангај, Кина). Квантитативни комплет БЦА протеина је купљен од Бостера (Вухан, Кина). Нањинг Јианцхенг (Нањинг, Кина) је обезбедио 5-ХТ, БДНФ, фактор некрозе тумора-алфа (ТНФ-), интерлеукин-1бета (ИЛ-1) и интерферон-гама (ИФН- ) комплети за ензимски имуносорбентни тест (ЕЛИСА). Комплети ЕЛИСА за кортикостерон (ЦОРТ), адренокортикотропни хормон (АЦТХ) и кортикотропин-ослобађајући хормон (ЦРХ) купљени су од компаније МултиСциенцес (Хангџоу, Кина). ЕЛИСА комплети за циклични аденозин монофосфат (цАМП), циклични гванозин монофосфат (цГМП), тестостерон (Т) и гонадотропин-ослобађајући хормон (ГнРХ) су купљени од Ензимске биотехнологије (Шангај, Кина). Триптофан и кинуренин ЕЛИСА комплети су добијени од Смалл Молецуле Антибодиес (Бордо, Француска). Примарна/секундарна антитела укључујући зонула оццлуденс 1 (ЗО-1), индолеамин 2, 3-диоксигеназу 1 (ИДО1), -актин и ХРП козји анти-зечји ИгГ (Х плус Л) купљена су од Протеинтецх-а (Вухан, Кина). Сви остали реагенси аналитичког квалитета или веће чистоће набављени су од комерцијалних добављача.

Припрема различитих фракција одвојених од ЦТЕ(Цистанцхеекстракт тубулоса)

ЦТ(Цистанцхетубулоза)је прикупљен у новембру 2015. године у Хетиану, Ксињианг, Кина, а аутентичност је потврдио проф. Ксиаобо Ли. Узорак ваучера (20151108) депонован је на Фармацеутском факултету на Шангајском универзитету Јиао Тонг.

Здробљени узорци су екстраховани три пута дестилованом водом (1:10, в/в) током 2 х на 80~90 ◦Ц да би се добио ЦТЕ(Цистанцхеекстракт тубулоса)(принос је био 57,1 одсто). ЦТЕ је растворен у дестилованој води, а затим полако мешан са етанолом (1:4, в/в) и стављен на 4 ◦Ц током 24 х. Затим су преципитат и супернатант сакупљени центрифугирањем на 4000 рпм током 20 мин. Укупни полисахариди (ТП; принос је био 5,7 процената) добијени су испирањем са 80 процената етанола и три пута депротеинизацијом Саваге реагенсом из прикупљеног талога. Преостали супернатант је затим хроматографисан преко Д101 колоне микропорозне смоле и елуиран дестилованом водом и 40% етанола. Елуиране фракције воде и 40 процената етанола садржале су укупне олигосахариде (ТО; принос је био 35,1 проценат) иукупногликозиди(ТГ; принос је био 12,1 посто), респективно. ТГ(укупни гликозиди)је даље елуиран са дестилованом водом и 5 процената, 10 процената и 40 процената етанола кроз Д101 микропорозну смолу поново, а елуиране фракције од 5 процената и 40 процената етанола су били укупни иридоидни гликозиди (ТГ-ИрГ; принос је био 2,7 процената) и укупни фенилетаноидни гликозиди (ТГ-ПхГ; принос је био 8,7 процената), респективно.

Хемијска анализа

Прво, главни хемијски састојци различитих фракција одвојени су од ЦТЕ(Цистанцхеекстракт тубулоса)су окарактерисани помоћу УПЛЦ-КТОФ-МС. Друго, релативни садржај укупних угљених хидрата и гликозида је одређен УВ-Вис методом. Треће, главне компоненте (ехинакозид, вербаскозид, вербаскозид, 8-епилоганска киселина и тенипозидна киселина) су квантификоване валидираном ХПЛЦ методом. Детаљни параметри и валидација метода су приказани у Додатним материјалима.

Експерименти на животињама

Специфични распореди експеримената на животињама су приказани на слици 1. Све експерименталне животиње су смештене и аклиматизоване 1 недељу пре експеримената у Центру за лабораторијске животиње Шангајског универзитета Јиао Тонг (Шангај, Кина), под контролисаним собним температурама (25 ± 2). ◦Ц; 55 ± 10 процената релативне влажности) са циклусом светло-мрак од 12:12 х. Ово истраживање је спроведено у складу са Смерницама за негу и употребу лабораторијских животиња СЈТУ. Објекти и протоколи за животиње су одобрени од стране Комитета за етику животиња СЈТУ (бр. А2019008).

Сто педесет мушких ИЦР мишева (тежине 18–20 г, старих 6 недеља) купљено је од Схангхаи Слацк Биотецхнологи Цомпани (Шангај, Кина) и насумично подељено у 10 група (н=15/група). Субјекти и дозе за мишеве очајног понашања у свакој групи приказани су у табели 1. Дозе ЦТЕ(Цистанцхеекстракт тубулоса) а његове издвојене фракције су израчунате по следећој формули: доза=4.55 г/кг.д.бв × принос, који је одређен према три прорачуна еквивалентне дозе за људе на основу површине тела. Дозе позитивног лека имипрамина и метаболита цревне микробиоте (3-ХПП и ХТ) су одређене према претходним студијама (Гупте ет ал., 2016; Паблос ет ал., 2019). Након интрагастричне примене једном дневно током 7 дана, тест на отвореном терену (ОФТ), тест суспензије репа (ТСТ) и тест принудног пливања (ФСТ) су обављени 8., 9. и 10. дана. Специфичне методе тестова понашања су наведене у Додатним материјалима.

Седамдесет два мужјака Спрагуе-Давлеи пацова (тежине 160–180 г, стари 6 недеља) купљена су од компаније Схангхаи Слацк Лаборатори Анимал Цомпани (Шангај, Кина). Пре формалних експеримената, сви пацови су били подвргнути тесту преференције сахарозе (СПТ) након одговарајуће обуке. Пацови су подељени у 8 група (н=9/групи) према њиховој преференцији сахарозе (додатна слика С1). Субјекти и дозе за пацове у свакој групи приказани су у табели 1. Дозе су постављене у складу са коефицијентом конверзије између миша и пацова на основу њихових ефективних доза код мишева са очајањем у понашању. А доза позитивног контролног лека флуоксетина била је у складу са претходном студијом (Хоу ет ал., 2017). Све групе су добиле серију хроничног непредвидивог благог стреса (ЦУМС) осим контролне групе. Стресори су примењивани континуирано и насумично током 4 недеље (погледајте додатну табелу С1 за детаље). Храна и вода су били слободно доступни контролним пацовима, који су остали неометани у другој просторији, осим за тестове понашања. Субјекти су давани интрагастрично 1 х пре ЦУМС процедуре током 4 недеље. После 28 дана континуираних стресора и примене лека, ОФТ, СПТ и ФСТ су изведени 29., 31. и 33. дана, респективно. Специфичне методе бихејвиоралних експеримената су приказане у Додатним материјалима.

Узимање узорака и биохемијска анализа

Након тестова понашања, пацови наташте су анестезирани пентобарбитал натријумом, а пуна крв је сакупљена да би се добили узорци серума. Након перфузије срца физиолошким раствором, садржај хипокампуса, дебелог црева и цекалног црева је сакупљен и ускладиштен на -80 ◦Ц. Дистални сегменти дебелог црева су уклоњени и фиксирани у 4% параформалдехида. Нивои ЦОРТ, ЦРХ, АЦТХ, ТНФ-, ИЛ-1, ИФН-, цАМП, цГМП, Т, ГнРХ, триптофана и кинуренина у серуму, 5-ХТ, БДНФ и ТНФ- у хипокампусу, а ТНФ- и ИФН- у дебелом цреву су мерени у складу са упутствима приложеним уз одговарајуће ЕЛИСА комплете.

Хистологија, имунохистохемија и Вестерн-блоттинг тест

Хематоксилин и еозин (Х&Е) и Алциан блуе-периодиц ацид-Сцхифф (АБ-ПАС) бојење су коришћени за посматрање патолошких промена у ткиву дебелог црева. Поред тога, извршене су имунохистохемијске процене ових секција да би се посматрала експресија протеина ЗО-1 у епителним ћелијама дебелог црева (Динг ет ал., 2020). Детаљи у вези са припремом узорка и вестерн-блоттинг тестом за одређивање експресије ИДО1 протеина у дебелом цреву и хипокампусу такође су описани у Додатним материјалима.

Анализа композиционог профила цревне микробиоте

Секвенцирање 16С рРНА високе пропусности извршио је МајорБио Цо., Лтд. (Шангај, Кина), а детаљна метода и обрада података приказани су у Додатним материјалима.

Статистичка анализа

Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна грешка средње вредности (СЕМ). Једносмерна анализа варијансе (АНОВА) је коришћена за поређење више група коришћењем софтвера СПСС 20.0. Разлика се сматра значајном при п < 0,05.="" корелације="" између="" цревних="" микроба="" и="" одређених="" физиолошких="" фактора="" повезаних="" са="" депресијом="" анализиране="" су="" коришћењем="" спеармановог="" коефицијента="" корелације="" на="" основу="" анализе="" топлотне="">

Резултати

Хемијска анализа различитих фракција издвојених из ЦТЕ(Цистанцхеекстракт тубулоса)

Главне компоненте су окарактерисане коришћењем УПЛЦ-КТОФ-МС (додатна табела С2 и слика С2), а идентификован је укупно 21 састојак, укључујући 16 састојака фенилетаноидних гликозида, 2 састојка фенолних гликозида у ЦТЕ(Цистанцхеекстракт тубулоса), ТГ и ТГ-ПхГ; и 3 састојка иридоидних гликозида у ЦТЕ(Цистанцхеекстракт тубулоса), ТГ и ТГ-ИрГ. Све у свему, релативни садржај укупних угљених хидрата у ТП и ТО износио је 60,3 одсто и 80,8 одсто, респективно. Релативни садржајиукупногликозидиу ТГ је било 87,7 одсто. Сходно томе, фенилетаноидни и иридоидни гликозиди су чинили 86,7 процената и 53,4 процената ТГ-ПхГ и ТГ-ИрГ, респективно. Садржај ехинакозида, вербаскозида, вербаскозида, 8- епилоганске киселине и тенипозидне киселине у свакој фракцији је приказан у табели 2, а подаци о ХПЛЦ хроматограму и валидацији методе наведени су у додатној табели С3 и слици С3.

Ефекти различитих фракција одвојених од ЦТЕ(Цистанцхеекстракт тубулоса)и типичне метаболите микробиоте црева на тестовима понашања код мишева

Као што је приказано на слици 2, у поређењу са контролном групом, мишеви подвргнути 7 дана примене имипрамина (позитивна контрола) показали су значајно смањење времена непокретности и код ФСТ и код ТСТ и нису показали значајан утицај на укупну пређену удаљеност у ОФТ-у. . Сличне промене су такође примећене у ЦТЕ(Цистанцхеекстракт тубулоса), ТГ и ХТ групе, што указује да су ЦТЕ, ТГ(укупни гликозиди), а ХТ је испољио антидепресивну активност и ефекти нису били повезани са ексцитабилности. Дакле, ТГ(укупни гликозиди)и ХТ су били доминантна биоактивна фракција одвојена од ЦТЕ и типичних метаболита помоћу цревне микробиоте, респективно. Занимљиво је да нису показане значајне промене у временима непокретности у ФСТ након примене ТГ-ПхГ и ТГ-ИрГ у поређењу са онима код контрола, или у ТСТ након примене ТГ-ПхГ, што указује да би присуство фенилетаноидних и иридоидних гликозида могло бити од суштинског значаја у антидепресивној активности ЦТЕ.

Фармакодинамички ефекти и биохемијске промене различитих фракција обогаћених гликозидима и ХТ на ЦУМС пацовима

Као што је приказано у табели 3, пацови подвргнути 28 дана ЦУМС парадигме показали су значајно смањење (п < 0.00}1)="" преференције="" сахарозе="" у="" спт-у,="" укупно="" пређено="" растојање,="" и="" број="" узгоја="" у="" офт,="" као="" и="" значајно="" повећање="" (п="">< 0,01)="" укупног="" времена="" непокретности="" у="" фст="" у="" поређењу="" са="" контролама,="" што="" указује="" на="" индукцију="" фенотипова="" сличних="" депресији="" код="" цумс="" пацова.="" депресивне="" перформансе="" су="" обрнуте="" у="" флкс="" (позитивна="" контрола)="" групи.="" слично,="" третман="" цте,="" тг,="" тг-пхг,="" тг-ирг="" и="" хт="" довео="" је="" до="" враћања="" преференције="" сахарозе="" на="" нормалне="" нивое="" код="" цумс="" пацова,="" који="" су="" износили="" 102,7="" процената,="" 94,1="" процената,="" 89,8="" процената,="" 91,9="" процената="" и="" 94,3="" процената="" пацова.="" контроле,="" односно.="" конзистентно="" у="" фст,="" цте="" и="" тг="" групама="" су="" испољиле="" најочигледније="" ефекте,="" а="" времена="" непокретности="" су="" достигла="" 103,3="" одсто="" и="" 93,4="" одсто="" оних="" у="" контролној="" групи,="" респективно,="" док="" су="" времена="" непокретности="" тг-пхг,="" тг-ирг="" и="" хт="" група="" управо="" достигао="" 62,1="" одсто,="" 73,2="" одсто="" и="" 69,9="" одсто="" оних="" из="" контролне="" групе.="" слична="" значајна="" повећања="" (п="">< 0,05)="" примећена="" су="" у="" укупном="" пређеном="" путу="" и="" ​​броју="" узгоја="" у="" офт="" након="">(Цистанцхеекстракт тубулоса), примена ТГ и ХТ, и третман ТГ-ПхГ и ТГ-ИрГ је имао тенденцију ка ревизији броја узгоја код ЦУМС пацова. Резултати су показали да је ТГ доминантна фракција биоактивног антидепресива одвојена од ЦТЕ, а фенилетаноидни и иридоидни гликозиди су били неопходни у испољавању његовог антидепресивног дејства. Штавише, показало се да је ХТ један од активних метаболита ТГ ин виво.

Конзистентно, обољење од ЦУМС значајно је повећало нивое ЦОРТ, ЦРФ, АЦТХ, ТНФ-, ИЛ-1 и ИФН- у серуму и ТНФ- у хипокампусу пацова у поређењу са онима у контролној групи (п< 0.05),="" resulting="" in="" significant="" reductions="" (p="" <="" 0.05)="" in="" the="" levels="" of="" hippocampal="" 5-ht="" and="" bdnf="" (fig.="" 3).="" except="" for="" a="" non-significant="" difference="" in="" the="" level="" of="" hippocampal="" bdnf="" between="" flx="" and="" cums="" groups,="" the="" above-mentioned="" alterations="" in="" cums="" rats="" could="" be="" significantly="" reversed="" (p="" <="" 0.05)="" after="" administration="" of="" fluoxetine,="" cte="">(Цистанцхеекстракт тубулоса), ТГ и ХТ, што указује да су ЦТЕ, ТГ(укупни гликозиди), и ХТ су показали мелиоративне ефекте на хиперактивацију ХПА осе, тешку периферну и неуралну инфламацију и недостатке {{0}}ХТ и БДНФ. Слично, третман ТГ-ИрГ и ТГ ПхГ значајно је смањио нивое серумског ЦОРТ, ТНФ-, ИФН- и ТНФ-а хипокампуса и повећао ниво хипокампалног 5-ХТ код ЦУМС пацова (п < {{8}="" }.05).="" значајно="" смањење="" (п="">< 0.05)="" нивоа="" серумског="" црф-а="" и="" ацтх="" такође="" је="" примећено="" у="" тг-ирг="" групи="" у="" поређењу="" са="" групом="" цумс.="" занимљиво="" је="" да="" су="" нивои="" цорт,="" тнф-,="" ацтх="" и="" црф="" у="" серуму="" у="" тг-пхг="" и="" тг-ирг="" групама="" били="" значајно="" виши="" од="" оних="" у="" тг="" групи="" (п="">< 0,05),="" а="" нивои="" хипокампалног="" 5-хт="" и="" бднф="" је="" показао="" супротан="" образац="" експресије="" (п="">< 0,05).="" ови="" резултати="" су="" показали="" да="" су="" ефекти="" тг-пхг="" и="" тг-ирг="" на="" хиперактивност="" хпа="" осе,="" периферну="" и="" неуралну="" упалу="" и="" недостатак="" 5-хт="" јасно="" инфериорни="" у="" односу="" на="" тг,="" што="" указује="" на="" то="" да="" фенилетаноид="" и="" иридоидни="" гликозиди="" могу="" деловати="" синергистичких="" ефеката="" на="" горе="" поменуте="" вишеструке="">

ТГ и ХТ регулишу ХПГ осу и циклични метаболизам нуклеотида код ЦУМС пацова

Измерени су нивои Т, ГнРХ, цАМП и цГМП и однос цАМП и цГМП (цАМП/цГМП) у серуму подвргнутом ЦУМС, а резултати су приказани у табели 4. Концентрације Т, ГнРХ, цАМП, и цАМП/цГМП у серуму су значајно смањени, а ниво цГМП је значајно повећан (п < 0.05)="" у="" цумс="" групи="" у="" поређењу="" са="" контролама,="" што="" указује="" да="" је="" подвргнутост="" цумс-у="" резултирала="" супресијом="" хпг="" осе="" и="" дисфункција="" цикличног="" метаболизма="" нуклеотида.="" у="" поређењу="" са="" цумс="" групом,="" није="" било="" значајних="" промена="" у="" флкс="" групи.="" изненађујуће,="" након="">(укупни гликозиди)и ХТ третмана, дошло је до значајног повећања (п < {{0}}}.05)="" нивоа="" серумског="" т,="" гнрх,="" цамп="" и="" цамп/цгмп,="" док="" је="" ниво="" цгмп="" у="" серуму="" значајно="" смањен="" (п="">< 0,05).="" ови="" резултати="" су="" показали="" да="">(укупни гликозиди)и ХТ су регулисали ХПГ осу и метаболизам цикличних нуклеотида, што је било изразито супериорно у односу на позитивну контролу флуоксетина.

ТГ и ХТ ублажавају упалу ниског степена у дебелом цреву и поремећај цревне баријере код ЦУМС пацова

Х&Е бојење је коришћено за процену морфолошког оштећења дебелог црева, а међу експерименталним групама нису примећене значајне разлике у дебелом цреву (слика 4а). Даље, анализирани су и ефекти ТГ и ХТ на запаљење дебелог црева и поремећај цревне баријере (Слика 4б-д). У поређењу са контролном групом, број пехарастих ћелија и дебљина слоја слузи су смањени у ЦУМС групи. Конзистентно, експресија протеина ЗО-1 и нивои ИФН- и ТНФ- у дебелом цреву су значајно смањени (п < 0.05)="" и="" повећани="" (п="">< 0,05="" ),="" респективно,="" што="" сугерише="" да="" иако="" није="" индуковано="" очигледно="" хистолошко="" оштећење,="" подвргнуто="" цумс-у="" је="" довело="" до="" упале="" ниског="" степена="" у="" дебелом="" цреву="" и="" поремећаја="" цревне="" баријере.="" након="" флуоксетина,="">(укупни гликозиди), и третманом ХТ, повећан је број пехарастих ћелија и дебљина слоја слузи, а значајно смањени нивои ИФН- и ТНФ-а у дебелом цреву (п < 0.05).="" поред="" тога,="" тг="" и="" хт="" су="" значајно="" повећали="" (п="">< 0,05)="" експресију="" протеина="" зо-1="" на="" ниво="" сличан="" оном="" у="" контролној="" групи.="" ови="" резултати="" су="" показали="" да="">(укупни гликозиди)и ХТ би могао да ублажи упалу ниског степена у дебелом цреву и поремећај цревне баријере код ЦУМС пацова.

Ефекти ТГ и ХТ на састав микробиоте црева

Након уклањања неквалификованих секвенци, добијено је укупно 1.874.721 ефективно очитавање. Резултати алфа разноврсности (слика 5а) и бета разноврсности (слика 5б) показали су да иако се богатство (Цхао) и разноликост (Сханнон) цревне микробиоте у садржају цекалног црева није разликовало, укупна структура микробиоте црева у дијаграм анализе главних координата (ПЦоА) показао је упадљиву разлику између контролних и ЦУМС група. Штавише, ТГ(укупни гликозиди)и ХТ третман значајно је повећао богатство бактерија ЦУМС пацова и изазвао значајне разлике у ПЦоА дијаграму у поређењу са онима код ЦУМС пацова, показујући јасне сличности са контролама, посебно када је ТГ(укупни гликозиди)био је анализиран.

Таксономске промене у микробиоти додатно су потврдиле да је ТГ(укупни гликозиди)извршио драматичан регулаторни ефекат на састав цревне микробиоте. Након ТГ(укупни гликозиди)администрације, бројност већине измењених таксона код ЦУМС пацова је обрнута на ниво сличан онима у контролној групи. Значајно смањење (14,2 процената, п < 0.05)="" и="" обогаћивање="" (53,6="" процената,="">< 0.05)="" in="" the="" abundances="" of="" the="" phylum="" firmicutes="" and="" bacteroidetes="" were="" observed="" in="" the="" tg="">(укупни гликозиди)група у поређењу са групом ЦУМС (слика 5ц), респективно. Конзистентно, на нивоу породице (Допунска табела С4), ТГ је смањио бројност Руминокока (врста Фирмицутес) и Пептоцоццацеае (врста Фирмицутес) за 33,9 процената и 82,9 процената, респективно, у поређењу са групом ЦУМС (п < 0="" {{10}}5).="" супротно="" томе,="" значајно="" обогаћивање="" у="" обиљу="" породице="" ерисипелотрицхацеае="" (филум="" фирмицутес,="" 78,4="" процената,="" п="">< 0,05)="" и="" мурибацулацеае="" (тип="" бацтероидетес,="" 77,3="" процената,="" п="">< 0,05)="" постојало="" је="" у="" тг="" групи.="" конзистентно="" на="" нивоу="" рода="" (слика="" 5д),="" обиље="" анаеротрунцус,="" ​​харрифлинтиа,="" руминицлостридиум_9,="" некласификованих_ф_руминоцоццацеае="" (чланови="" породице="" румино-цоццацеае)="" и="" пептоцоццус="" (члан="" породице="" пептоцоццацеае)="" је="" значајно="" смањен="" док="" су="" норанк_ф_ерисипелотрицхацеае,="" алло="" бацулум,="" дубосиелла="" (чланови="" породице="" ерисипелотрицхацеае)="" и="" норанк_ф{{24}="" }мурибацулацеае="" (члан="" породице="" мурибацулацеае)="" показао="" је="" веће="" заступљености="" у="" тг="" групи="" од="" оних="" у="" цумс="" групи="">< 0.05).="" in="" addition,="" tg="" decreased="" the="" abundances="" of="" tyzzerella_3,="" acetatifactor,="" and="" norank_f_lachnospiraceae="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae="" (p="" <="" 0.05),="" although="" the="" abundance="" of="" the="" family="" lachnospiraceae="" was="" similar="" across="" all="" experimental="" groups.="" unlike="" tg,="" ht="" decreased="" the="" abundances="" of="" partially="" altered="" taxa="" induced="" by="" cums,="" including="" the="" family="" ruminococcaceae,="" 3="" genera="" (anaerotruncus,="" harryflintia,="" and="" ruminiclostridium_9)="" assigned="" to="" the="" family="" ruminococcaceae="" and="" 2="" genera="" (tyzzerella_3,="" acetatifactor)="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae.="" additionally,="" converse="" variations="" were="" observed="" in="" the="" abundances="" of="" ruminococcaceae_ucg_013="" and="" streptococcus="" in="" the="" ht="" group.="" these="" results="" indicated="" that="" tg="" and="" ht="" exerted="" clear="" differences="" in="" the="" regulation="" of="" gut="" microbiota="" composition,="" and="" the="" effect="" of="" tg="" was="" superior="" to="" that="" of="" tg="" especially="" in="" altering="" the="" genera="" assigned="" to="" the="" family="" erysipelotrichaceae,="" peptococcaceae,="" and="">

Корелациона анализа измењених микробних родова захваћених ТГ(укупни гликозиди)и ХТ, хормони повезани са ХПА осовином, проинфламаторни цитокини, 5-ХТ и БДНФ

Да би се разјасниле везе између промена у саставу цревне микробиоте на које утиче ТГ(укупни гликозиди)и ХТ, и одговарајућих особина повезаних са депресијом, извршена је Спеарманова корелација. Као што је приказано на слици 6, нивои 5-ХТ и БДНФ у хипокампусу су само значајно позитивно корелирали са норанк_ф_Мурибацулацеае. У супротном, могу се идентификовати јасне корелације између измењених микробних родова и хормона повезаних са ХПА осовином. Конкретно, Дубосиелла, норанк_ф_Мурибацулацеае, норанк_ф_ Ерисипелотрицхацеа и Пептоцоццус су били снажно повезани са функцијом ХПА осе. Серум ЦОРТ, ЦРФ и АЦТХ су имали негативне корелације са Дубосиелла, норанк{{10}ф_Мурибацулацеае и норанк_ф_Ерисипелотрицхацеа, и позитивне асоцијације са Пептоцоццус. Штавише, Дубосиелла и норанк_ф_ Ерисипелотрицхацеа су показале негативне асоцијације са ИФН- и хипокампалним ТНФ- , док су сличне везе постојале у Аллобацулуму, Харрифинита и серуму и ТНФ-у хипокампуса, као и код норанк-а _ф_Лацхноспирацеа и серумски ИФН- и ТНФ-. Насупрот томе, Пептоцоццус је био позитивно повезан са ТНФ- и серумским ТНФ-ом у дебелом цреву. Слично, норанк_ф_Мурибацулацеае је био позитивно повезан са ИФН- и ТНФ- у серуму. Ови резултати су показали да су измењени микробни родови, посебно одређени родови који припадају породици Ерисипелотрицхацеае, Пептоцоццацеае и Мурибацулацеае, на које је ТГ посебно утицао, показали снажну повезаност са хормонима повезаним са ХПА осовином и проинфламаторном критичном улогом цитокина, истовремено микробиоте црева у регулисању функције ХПА осе и упале.

ТГ(укупни гликозиди)и ХТ инхибирају метаболизам триптофан-кинуренина код ЦУМС пацова

Ефекти ТГ(укупни гликозиди)и ХТ на нивое триптофана и кинуренина у серуму пацова, као и експресија ИДО1 у дебелом цреву и хипокампусу. Као што је приказано на сликама 7 и 8, у поређењу са контролном групом, ниво триптофана у серуму је значајно смањен у ЦУМС групи, за разлику од повећаног нивоа кинуренина и односа кинуренин-триптофан (Кин /Трп) и експресија протеина ИДО1 у дебелом цреву и хипокампусу. У поређењу са ЦУМС групом, серум Кин/Трп у ФЛКС групи је значајно смањен (стр< 0.05).="" tg="">(укупни гликозиди)и ХТ третман је резултирао значајним повећањем нивоа триптофана у серуму код ЦУМС пацова (п < {{0}}.05),="" и="" смањењем="" нивоа="" кинуренина="" у="" серуму="" и="" кин/трп="" (п="">< 0,05).="" поред="" тога,="" тг="" је="" значајно="" инхибирао="" експресију="" идо1="" протеина="" у="" дебелом="" цреву="" цумс="" пацова="" (п="">< 0,05),="" док="" је="" уочена="" незнатна="" разлика="" у="" експресији="" идо1="" протеина="" у="" хипокампусу="" између="" цумс="" и="" тг="" група.="" међутим,="" ефекат="" хт="" на="" експресију="" идо1="" протеина="" у="" дебелом="" цреву="" и="" хипокампусу="" био="" је="" у="" супротности="" са="" тг,="" што="" указује="" да="" тг="" и="" хт="" инхибирају="" метаболизам="" триптофан-кинуренина="" смањујући="" експресију="" идо1="" у="" дебелом="" цреву="" и="" хипокампусу="" цумс="" пацова,="" респективно.="">

Дискусија

У овој студији, два различита животињска модела су коришћена за скрининг биоактивних једињења у ЦТ(Цистанцхетубулоза)који по први пут ублажавају понашања слична депресији. ТП и ТО су највероватније били неефикасни састојци у ЦТЕ, док су ТГ(укупни гликозиди)показао највећи потенцијал у лечењу депресије. Претходне студије о ЦТ(Цистанцхетубулоза), добро каоЦистанцхебиљке, углавном су се фокусирали на биоактивност фенилетаноидних гликозида са највећим садржајем и занемарили значај иридоидних гликозида и других мање заступљених састојака. Занимљиво је да је наша студија показала да су фенилетаноиди и иридоидни гликозиди показали синергистичке ефекте на хиперактивност ХПА осе, тешку периферну и неуралну упалу и недостатке хипокампалног 5-ХТ и БДНФ-а, што може бити критичан разлог за користан антидепресив ефекат ТГ(укупни гликозиди). Ови резултати даље сугеришу вишекомпонентне и вишециљне карактеристике биљне медицине и подсећају нас да састојци са нижим нивоима, чак и састојци у траговима такође могу играти кључну улогу у фармаколошким ефектима.

Хронични стрес индукује хиперактивност ХПА осе, што промовише настанак депресије, као и супресију ХПГ осе преко смањеног ослобађања ГнРХ и/или хипофизне осетљивости ГнРХ (Кирби ет ал., 2009). У међувремену, цАМП и цГМП су важна средња чворишта која су се ослањала на многе неуротрансмитере и хормоне да би извршили своје физиолошке ефекте (Сиаврис ет ал., 2002). Недавне студије су доследно показале да је појава недостатка бубрега-јанга уско повезана са дисфункцијом осе хипоталамус-хипофиза-циљна жлезда (Зханг ет ал., 2019). Код синдрома недостатка бубрега-јанга, примећено је и значајно смањење нивоа цАМП и цАМП/цГМП у серуму. У овој студији смо открили да ТГ(укупни гликозиди)може инхибирати нивое ЦОРТ, ЦРФ и АЦТХ у серуму и повећати садржај Т и ГнРХ у серуму код ЦУМС пацова, што указује на опоравак дисфункције ХПА и ХПГ осе након примене ТГ. Поред тога, ТГ(укупни гликозиди)преокренуо значајно смањење нивоа цАМП/цГМП у серуму код пацова подвргнутих ЦУМС-у. Дакле, потенцијални основни механизам ЦТ(Цистанцхетубулоза) у лечењу депресије и недостатка бубрега-јанга може бити делимично сличан и заслужује да се даље истражује. Штавише, стварање сексуалне жеље и понашања је сложен процес нервног рефлекса. Полни хормони су главни извори централног сексуалног узбуђења и недостатак полних хормона може узроковати мању сексуалну жељу или сексуалну дисфункцију (Холловаи и Вилие, 2015). Конкретно, прекомерни 5-ХТ инхибира ослобађање ГнРХ, што је доминантан разлог за појаву хроничне сексуалне дисфункције након дуготрајног лечења ССРИ (Прасад ет ал., 2015). У нашој студији, флуоксетин (представник ССРИ) је био неефикасан у дисфункцији ХПГ осе. Међутим, иако је ТГ(укупни гликозиди)значајно побољшао ниво 5-ХТ у хипокампусу, такође су примећене сличне промене у серумским нивоима Т и ГнРХ, чиме је побољшана супресија ХПГ осе. Ови резултати показују изразиту предност ЦТ-а(Цистанцхетубулоза) у лечењу депресије, а унутрашњи механизам одговоран за ове ефекте треба даље проучавати.

Све већи број доказа показује да су црева потенцијална мета за лечење хроничних болести коришћењем природних једињења ниске биорасположивости (Зхоу ет ал., 2020). Недавна истраживања (Веи ет ал., 2019) су показала да ЦУМС третман изазива промене фекалног микробиома и дефекте цревне баријере, што олакшава инвазију бактерија у слузницу дебелог црева и погоршава инфламаторне реакције у дебелом цреву. У складу са тим извештајем, наши резултати су показали да је 4 недеље излагања ЦУМС-у изазвало значајно смањење броја пехарастих ћелија и дебљине слоја слузи у дебелом цреву пацова, као и почетак поремећаја цревне баријере представљен повећаном пермеабилности црева, што је одређено мерење ЗО-1 протеина. Поред тога, повећана експресија проинфламаторних фактора (као што су ТНФ- и ИФН-) уочена је у дебелом цреву. Сходно томе, ови налази су показали да, иако није индукована очигледна хистолошка оштећења, ЦУМС третман је иницирао упалу дебелог црева и поремећај цревне баријере. Претходне студије су известиле да је ЦТ показао побољшану ефикасност у превенцији колитиса изазваног ДСС код мишева (Јиа ет ал., 2014). Недоследно, ТГ(укупни гликозиди)такође се показало да ублажава упалу ниског степена у дебелом цреву и поремећај цревне баријере код ЦУМС пацова, што наглашава његов потенцијал за клиничко лечење болести повезаних са инфламацијом дебелог црева.

Опсежне студије су такође показале да је однос који повезује комензалну цревну микробиоту, ХПА осу и упалу сложен и игра кључну улогу у развоју депресије (Мисиак, ет ал., 2020). Промене у саставу цревне микробиоте могу допринети појачаном ослобађању цитокина и синтези малих биоактивних молекула (Ду ет ал., 2020). Одређени цитокини (као што је ТНФ-) могу проћи кроз крвно-мождану баријеру и моћни су активатори ХПА осе (Мисиак ет ал., 2020). Заузврат, хиперактивација ХПА осе може допринети дисбиози цревне микробиоте, хроничној упали у дебелом цреву и измењеној пермеабилности црева (Мисиак ет ал., 2020). У складу са претходним студијама, модификација цревне микробиоте леком ТГ вероватно је одговорна за њене ублажавајуће ефекте на депресију. Приметили смо да ТГ(укупни гликозиди)обрнуо обиље микробних таксона на различитим нивоима код пацова који су били подвргнути ЦУМС-у на ниво сличан оном код контрола. Конкретно, утврђено је да су главни измењени родови који припадају породици Пептоцоццацеае, Ерисипелотрицхацеае и Мурибацулацеае у великој корелацији са ХПА осом и упалом. У складу са нашим резултатима, пријављено је да породице Пептоцоццацеае, Ерисипелотрицхацеае и Мурибацулацеае играју важну улогу у одржавању интегритета мукозне баријере и појаве упале (Канкоусх, 2015; Бортон ет ал., 2017; Зханг ет ал., Зханг ет ал., 2020). Стога смо претпоставили да би ТГ могао да умањи обиље неких родова који су приписани породици Ерисипелотрицхацеа, Пептоцоццацеае и Мурибацулацеае, а затим ублажавају упалу ниског степена у дебелом цреву, хиперактивност ХПА осе и поремећај интегритета слузокоже. Занимљиво је да је у нашој студији само један род под називом нор анк_ф_Мурибацулацеае био у корелацији са 5-ХТ и БДНФ у хипокампусу. Конкретан механизам односа остаје нејасан и потребно га је додатно испитати. Иначе, налази такође сугеришу да је за већину измењених родова изазваних ТГ изузетно тешко да директно утичу на нивое 5-ХТ у хипокампусу. Да бисмо објаснили како промене у саставу цревне микробиоте утичу на ниво хипокампалног 5-ХТ после третмана ТГ, замршен однос који повезује метаболизам триптофана, ХПА осу, инфламаторне цитокине и 5-ХТ привукао је нашу пажњу. Триптофан је есенцијална аминокиселина за људе и мање од 1 процента се користи у синтези протеина, при чему већину (преко 90 процената) ИДО1 и триптофан 2,3-диоксигеназа 2 (ТДО2) претварају у кинуренине, и приближно 5 процената их покреће триптофан хидроксилаза низ серотонински пут (Дуан, ет ал. 2018). Ниво 5-ХТ у мозгу у великој мери зависи од периферне доступности триптофана, с обзиром да се триптофан транспортује у мозак преко неутралних аминокиселинских транспортера (Дуан ет ал., 2018). ИДО1, ензим који ограничава брзину у првом кораку кинуренин пута, првенствено је индукован ИФН- и другим проинфламаторним цитокинима, као што су ИЛ-1 и ТНФ- (Кеннеди ет ал., 2017), за које се показало да су повезани са микробиотом црева у нашој студији. Као што је објављено, више триптофана се метаболише путем кинуренина, чиме се компетитивно смањује конверзија триптофана у 5-ХТ и повезује се са смањеним 5-ХТ који се обично налази у депресији (О'Махони ет ал., 2015). Дакле, нижи нивои триптофана и виши Кин/Трп су уобичајени и поклапају се са повећаним ризиком од депресивног расположења. Након примене ТГ, прекомерна експресија ИДО1 у дебелом цреву је инхибирана, што је резултирало повећањем нивоа триптофана у серуму и смањењем Кин/Трп у серуму, што је открило потенцијалну везу између цревне микробиоте и хипокампуса 5-ХТ нивоа на који ТГ утиче. У међувремену, БДНФ, члан породице неуротрофина, неопходан је за диференцијацију ћелија, преживљавање неурона, формирање синапси и процесе неуропластичности у депресији (Греенберг ет ал., 2009). Недавне студије су показале да је откривено да је БДНФ блиско повезан са функцијом баријере цревне слузокоже и микробиотом црева (Максоод и Стоне, 2016). Такође, пријављено је да промене у микробиоти црева поседују потенцијал да повећају нивое експресије БДНФ и на тај начин утичу на развој понашања сличног депресији (Ду ет ал., 2020). Међутим, слично 5-ХТ варијацији, било је изузетно немогуће да већина измењених родова изазваних ТГ у нашој студији директно утиче на нивое БДНФ у хипокампусу, а интринзична молекуларна веза и механизам захтевају даље испитивање.

Насупрот томе, ХТ, метаболит микробиоте црева ТГ(укупни гликозиди), такође је показао антидепресивни ефекат у овој студији, што је у складу са његовом повољном неуропротективном активношћу (Ху ет ал., 2014). Забрињавајуће, ХТ би такође могао да умањи проинфламаторне цитокине, хормоне повезане са ХПА и ХПГ осовином и концентрацију хипокампуса 5-ХТ до нивоа сличног оном код контрола код ЦУМС пацова, док је већина измењених микробних родова погођена ХТ је имао слабу корелацију са горе наведеним физиолошким индексима, што сугерише да микробиота црева можда није мета антидепресивне активности ХТ. Штавише, ХТ је потиснуо прекомерну експресију ИДО1 у хипокампусу, али не и у дебелом цреву, праћен повећаним нивоима триптофана у серуму. Појава очигледних разлика између ТГ(укупни гликозиди)а ХТ може бити последица одличне апсорпције ХТ у крвоток и способности ХТ да пређе крвно-мождану баријеру (Роблес-Алмазан ет ал., 2018), што такође указује да је јак метаболички капацитет цревне микробиоте посебно важан у антидепресивној активности ТГ, поред његових физиолошких функција. Дакле, прелиминарно смо доказали да двосмерна интеракција фитокемикалија и цревне микробиоте игра кључну улогу у лечењу депресије применом ТГ (као што је приказано на слици 9).

Закључак

Укратко, ТГ(укупни гликозиди)био је углавном одговоран за антидепресивну активност ЦТ(Цистанцхетубулоза), што се одражава у синергистичким ефектима фенилетаноидних и иридоидних гликозида на хиперактивацију ХПА осе, тешку периферну и неуралну инфламацију и недостатке 5-ХТ и БДНФ у хипокампусу. Надаље, потенцијални молекуларни механизам антидепресивног ефекта ТГ(укупни гликозиди)постигнуто је двосмерном интеракцијом фитокемикалија и цревне микробиоте. Поред тога, побољшање потиснуте ХПГ осе и цикличне нуклеотидне абнормалности од стране ТГ(укупни гликозиди)и ХТ, који нису били регулисани третманом са ССРИ које представља флуоксетин, указали су на изразиту предност ЦТ у лечењу депресије. Такве модулације представљају обећавајућу стратегију за лечење депресије коришћењем ЦТ(Цистанцхетубулоза) и слични традиционални биљни лекови.

Прилози аутора

КСЛ, ИП и ЛФ дизајнирали су експерименте и анализирали податке. ЛФ и ЈВ су извели експеримент и анализирали податке. ЛФ и КСЛ су израдили рукопис. ПМ је допринео експерименту на животињама и тестирању узорака, а ЛЗ је допринео анализи састава микробиоте црева. Сви подаци су генерисани у компанији и није коришћена фабрика папира. Сви аутори су сагласни да буду одговорни за све аспекте рада обезбеђујући интегритет и тачност.

Изјава о конкурентским интересима

Аутори изјављују да нема сукоба интереса.

Признања

Овај рад је подржан грантовима из Националног кључног пројекта истраживања и развоја (2017ИФЦ1702400).

Допунски материјали

Додатни материјал повезан са овим чланком може се наћи, у онлајн верзији, на дои:10.1016/ј.пхимед.2021.153471.

Од: 'укупни гликозиди од стабљикаЦистанцхетубулосаублажавају понашања налик депресији: двосмерна интеракција фитокемикалија и цревне микробиоте'Ли Фан, ет ал

---Пхитомедицине 83 (2021) 153471/ хттпс://дои.орг/10.1016/ј.пхимед.2021.153471