Заштитни имунитет против САРС ЦоВ-2 инфекције код хрчака изазван вакцинацијом ДНК
Nov 17, 2023
Апстрактан
Развој ефикасних вакцина против ЦОВИД-19 је хитна потреба за глобално јавно здравље. Протеин шиљака тешког акутног респираторног синдрома коронавируса 2 (САРС-ЦоВ-2) је главна мета за ЦОВИД-19 вакцину. Да би се брзо одговорило на избијање пандемије САРС-ЦоВ-2, вакцина заснована на нуклеинским киселинама је нова опција, осим традиционалне вакцине против инактивираног вируса или рекомбинантне протеинске вакцине. Овде извештавамо о ДНК вакцини која садржи шик ген за испоруку путем електропорације. Шиљасти гени САРС-ЦоВ и САРС-ЦоВ-2 су оптимизовани кодонима за експресију ћелија сисара, а затим клонирани у векторе експресије ћелија сисара, назване пСАРС-С и пСАРС2-С, респективно. Експресија протеина шиљака је потврђена имуноблотингом након пролазне експресије у ћелијама ХЕК293Т. Након имунизације, серуми су сакупљени за анализу титра антитела специфичних за антиген и неутрализујућих антитела. Открили смо да имунизација пСАРС-С и пСАРС{{16}С изазива сличне нивое антитела против С2 САРС-ЦоВ-2. Насупрот томе, само пСАРС2-С имунизација је изазвала антитела против домена који се везује за рецептор САРС-ЦоВ-2. Даље смо открили да пСАРС2-С имунизација, али не и имунизација пСАРС-С, може да изазове веома високе титре неутралишућих антитела против САРС-ЦоВ-2. Даље смо анализирали САРС-ЦоВ-2 С протеин-специфичне Т-ћелијске одговоре и открили да су имуни одговори били пристрасни према Тх1. Важно је да имунизација пСАРС2-С код хрчака може да изазове заштитни имунитет против САРС-ЦоВ-2 изазова ин виво. Ови подаци сугеришу да би ДНК вакцинација могла да буде обећавајући приступ за заштиту од ЦОВИД-19.
цистанцхе користи-јача имуни систем
Сажетак аутора
САРС-ЦоВ-2 наставља да угрожава глобално здравље, а развој вакцине против САРС-ЦоВ-2 је хитан приоритет за заустављање епидемије ЦОВИД-19. Овде смо развили ДНК вакцине које садрже шик ген из САРС-ЦоВ-2 и испоручене путем електропорације. Приметили смо да је ДНК вакцина изазвала дуготрајан хуморални одговор против САРС-ЦоВ-2, а изазвана серумска антитела су ефикасно блокирала везивање САРС-ЦоВ-2 РБД за његов улазни рецептор (АЦЕ2). Важно је да је ДНК вакцина изазвала снажне Тх1-пристрасне имуне одговоре против САРС-ЦоВ-2, што би могло да пружи заштитни ефекат са малим нежељеним ефектима. Коначно, показали смо да САРС-ЦоВ-2 ДНК вакцина даје заштитну ефикасност против инфекције САРС-ЦоВ-2 код сиријских хрчака. Наши налази сугеришу да би ДНК вакцинација могла да буде користан приступ за контролу пандемије ЦОВИД{20}} у блиској будућности.
Увод
Нова заразна болест ЦОВИД-19, узрокована тешким акутним респираторним синдромом повезаним са коронавирусом 2 (САРС-ЦоВ-2), имала је значајне економске последице у земљама погођеним избијањем болести у периоду 2019–2020.1]. Глобално, било је више од 118 милиона потврђених случајева ЦОВИД-19, а више од 2,6 милиона људи је умрло од ЦОВИД-19, до марта 2021. [2]. Глобална стопа смртности је око 2,2%. Иако је стопа смртности од САРС-ЦоВ-2 нижа од оне од инфекције МЕРС-ЦоВ и САРС-ЦоВ, његова преносивост је већа. Неколико вакцина против ЦОВИД-19 је одобрено за хитну употребу у децембру 2020. године, али пандемија ЦОВИД{8}} остаје међународна претња у време писања овог текста.
цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем
Протеин Спике (С) је површински протеин коронавируса који је одговоран за процесе везивања вируса за ензим који конвертује ангиотензин 2 (АЦЕ2) рецептора домаћина, улазак у ћелију и фузију мембране вируса и ћелије ради ослобађања вирусне РНК у ћелије домаћина. Међу структурним протеинима САРС-ЦоВ, шиљасти протеин је доминантни антиген који индукује неутрализујућа антитела [3]. На основу претходних студија о САРС-у и МЕРС-у, доказано је да вакцине засноване на С протеинима изазивају неутрализирајућа антитела и имуни одговор Т ћелија на коронавирусе и штите животиње од изазивања вируса [4, 5]. Због високе имуногености С протеина, могао би бити потенцијална мета за развој САРС-ЦоВ-2 вакцине [5–7]. Кандидати за вакцину против ЦОВИД-19 могу се развити коришћењем инактивираног вируса, рекомбинантних или синтетичких компоненти вируса, рекомбинантног вируса или вирусне иРНК или ДНК. Последњи приступ је посебно атрактиван јер се вирусна ДНК може брзо и лако испоручити широм света без система хладног ланца. Штавише, потпуно синтетичка ДНК изведена из секвенце која кодира вирусни протеин могла би да изазове и хуморални и ћелијски посредован имуни одговор против патогена.8, 9].
ДНК вакцина је идеална платформа за вакцину са неколико предности, укључујући једноставан дизајн и производњу, стабилност на различитим температурама и ниске трошкове производње. Дакле, платформа ДНК вакцине је погодна за брзу и масовну производњу током избијања заразних болести. Претходне студије су објавиле да ДНК вакцине могу ефикасно стимулисати ћелијске и хуморалне одговоре против патогена у моделима изазова [10]. Штавише, недавне клиничке студије су показале да су ДНК вакцине безбедни и ефикасни кандидати за лечење или превенцију заразних болести, као што су ХИВ-1, Зика вирус, Ебола вирус, МЕРС-ЦоВ и вируси грипа [11]. Како се пандемија ЦОВИД-19 ширила глобално и озбиљно, недавне студије су објавиле да су ДНК вакцине изазвале Т-ћелијске одговоре специфичне за антиген и неутралишућа антитела и додатно заштитиле животиње од изазова САРС-ЦоВ-2 [12, 13].
Главни изазов ДНК вакцина је слаба ефикасност испоруке ДНК у ћелије за експресију антигена и последично слаба ефикасност вакцина. Да би се повећала ефикасност испоруке ДНК, могу се користити физичке или хемијске методе. Физичке методе укључују струју ваздуха под високим притиском (тј. Биојектор), испоруку ДНК обложене златним честицама помоћу генског пиштоља, низ микроиглица и електропорацију (ЕП). Хемијске методе укључују липозоме, виросоме, наночестице и пептиде који продиру у ћелије [14]. Током избијања Зика вируса 2015. године, Зика ДНК вакцина испоручена електропорацијом је развијена у клиничко испитивање фазе 1 у року од 7 месеци [15]. ЕП у комбинацији са ДНК вакцинацијом у великој мери повећава ефикасност ДНК вакцина [16–18]. Због успешних резултата експеримената на животињама након ДНК вакцинације са ЕП, развијено је много различитих уређаја за електропорацију за људе, укључујући Целлецтра® (Иновио Инц., САД) и ТриГрид® (Ицхор Медицал Системс, САД).
Ова студија описује ДНК вакцинацију са ЕП која може да изазове неутрализујућа антитела и Тх{0}}пристрасне имунолошке одговоре. Хрчци имунизовани овом техником генерисали су неутрализујућа антитела против САРС-ЦоВ-2. Штавише, имунизовани хрчци су показали заштитни имунитет у изазову вируса САРС-ЦоВ-2.
Методе
Етичка изјава
Све експерименталне протоколе на животињама одобрио је Институционални комитет за негу и употребу животиња (ИАЦУЦ) НХРИ (Протокол бр: НХРИ-ИАЦУЦ-109077-А).
Целл Линес
Ћелијска линија људског ембриона бубрега ХЕК293Т култивисана је у Дулбеццо-овом модификованом Еагле-овом медијуму (ДМЕМ, ГИБЦО) са додатком 10% топлотно инактивираног феталног говеђег серума (ФБС, ХиЦлоне), 100 У/мЛ пеницилина/стрептомицина (ГИБ2лумМ) и (ГИБЦО). Веро ћелије су култивисане у медијуму М199 (ГИБЦО) са 5% ФБС на 37 степени.
Титрација вируса
САРС-ЦоВ-2 варијанте (хЦоВ-19/Таиван/4/2020 и хЦоВ-19/Таиван/78/2020 (Д614Г варијанта)) добијене су од Центара за контролу болести (ЦДЦ) ) на Тајвану. Вирус је амплификован у Веро ћелијама узгајаним у медијуму М199 са додатком 2 уг/мЛ ТПЦК-трипсина (Сигма) на 37 степени. Титар вируса је одређен у смислу инфективне дозе културе ткива од 50% (ТЦИД50) коришћењем стандардне методе [19]. Укратко, Веро ћелије су засејане (2,4 × 104 ћелије/по бунарчићу) у 96- плоче са бунарима и култивисане у медијуму М199 са 5% ФБС на 37 степени током 24 сата да би се формирао монослој. Следећег дана, припремљена су серијска 10- пута разблажења, и разблажени вирус (100 μЛ/бажирић) је додат на монослојеве Веро ћелија са осам понављања по разблажењу. После 4 дана инкубације на 37 степени, забележени су вирусом индуковани цитопатски ефекти (ЦПЕ) у сваком базенчићу, а резултати су изражени као ТЦИД50/мЛ према методи Реед-а и Муенцха. Сви експерименти са САРС-ЦоВ-2 спроведени су у лабораторији нивоа биолошке безбедности 3 (БСЛ-3) и одобрени су од стране Тајванског ЦДЦ-а.
цистанцхе користи-јача имуни систем
Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити
【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692
Конструкција и карактеризација плазмида
ДНК секвенце које кодирају САРС-Спике пуне дужине (ГенБанк приступни број ДК412574) и САРС-ЦоВ-2 шиљасте гене (ГенБанк приступни број: МН908947) оптимизоване су за употребу кодона миша и синтетизоване су од стране ГенСцрипт Биотецх-а. Различити фрагменти С (тРБД, тРБДТМ, тСАРС2-С, тСдТМ) су такође конструисани и амплификовани појединачно ПЦР-ом. Сви гени су субклонирани у клинички коришћени вектор пВАКС1 са Козак секвенцом уграђеном у 5' крај гена. Плазмид је трансформисан у ДХ5 Е. цоли за амплификацију плазмида. Плазмиди су екстраховани и пречишћени коришћењем Киаген колонског система без ендотоксина (ЕндоФрее Пласмид Мега Кит).
Трансиент Екпрессион анд Вестерн Блот
Ћелије ХЕК293Т су трансфектоване са назначеним ДНК плазмидима коришћењем ПолиЈет™ реагенса (СигнаГен Лабораториес) у складу са протоколом произвођача. 24 сата након трансфекције, ћелијски лизати су сакупљени и подвргнути електрофорези на 8% СДС-ПАГЕ. Протеини су затим пребачени на ПВДФ мембране и блотирани зечјим анти-спике поликлонским антителом (40592-Т62, Сино Биологицал). Као секундарно антитело коришћена су анти-зечја антитела коњугована са пероксидазом хрена (ХРП). Специфични протеини на мембрани су визуелизовани помоћу ЕЦЛ реагенса (Тхермо Сциентифиц).
Имунизација животиња
БАЛБ/ц, Ц57БЛ/6 мишеви и сиријски хрчци су добијени од Националног лабораторијског центра за узгој и истраживање животиња (Тајпеј, Тајван). Мишеви или хрчци су коришћени између 6 и 12 недеља старости. Анестезирани мишеви или хрчци су вакцинисани са 100 μЛ раствора који садржи назначену ДНК у 3-недељном интервалу, након чега је уследила електропорација са БТКС електропоратором (ЕЦМ830) коришћењем електрода са две игле (пречник 5- мм ( БТКС 45–0121)). Интрамускуларна електропорација је изведена при константном напону од 75 В са 10 импулса при 50 мсец/пулсу и интервалима од 100 мс између импулса. Узорци крви мишева и хрчака прикупљени су субмандибуларним или ретроорбиталним узорцима крви, респективно. Све животиње су смештене у Центру за лабораторијске животиње Националног института за здравствена истраживања (НХРИ) и одржаване у складу са институционалним протоколима за негу животиња.
Имунолошки тест
Присуство С-специфичних антитела у серуму је одређено ЕЛИСА тестом. Укратко, 50 μЛ рекомбинантног протеина од 4 уг/мЛ (Сино Биологицал) у 0.1 М карбонатном пуферу (пХ 9,5) је премазано на 96- микроплоче у бунарима инкубацијом преко ноћи на 4 степен . Обложене плоче су два пута испране са 0,05% Твеен 20 у ПБС и затим блокиране са 3% БСА у ПБС на собној температури током 2 сата. Разблажени серуми имунизованих животиња су нанети на бунарчиће на собној температури током 2 сата. Након додавања ХРП-коњугованог козјег анти-мишјег ИгГ (Тхермо Сциентифиц) или ХРП-коњугованог козјег ИгГ против хрчка (Ариго Биолабораторие), тест је развијен коришћењем СуреБлуе ТМБ 1-компонентног супстрата пероксидазе (КПЛ). Апсорбанца је мерена коришћењем ЕЛИСА читача на 450 нм.
Неутрализација инфекције вирусом САРС-ЦоВ{1}}
Веро ћелије су засејане (2,4×104 ћелије/бунарићу) у 96-плоче са бунарима током 24 х да би се формирао монослој. Преимуни серуми и антисеруми против САРС-ЦоВ-2 С протеина претходно су третирани на 56 степени у трајању од 30 минута да би се уништиле неспецифичне вирусне инхибиторне супстанце лабилне на топлоту. Серуми су разблажени до почетног разблажења од 1/20 са медијумом М199, додати у бунар који садржи 200 ТЦИД50 САРС-ЦоВ-2 вируса у запремини од 0,2 мЛ, а затим инкубирани на 37 степени током 2 сата. Након тога, смеша вирус-серум је инокулисана на монослојеве Веро ћелија и инкубирана на 37 степени. За свако разблаживање серума припремљени су четири дупликати. Карактеристике ЦПЕ у свакој јажици су забележене након 4-5 дана инкубације. Титар неутрализације био је пропорционалан највећем разблажењу серума које је спречило инфекцију у 50% четвороструких инокулација.
АЦЕ2 Цомпетитион ЕЛИСА
АЦЕ2 такмичарска ЕЛИСА је изведена коришћењем комплета за серолошки тест титра антитела против САРС-ЦоВ-2 (АЦРОБиосистемс) у складу са препорученим протоколом. Укратко, 96-плоче са бунарима су обложене са 0.5 уг/мЛ САРС-ЦоВ-2-С РБД протеина преко ноћи на 4 степена. Плоча је испрана и блокирана пуфером за блокирање на 37 степени током 1,5 сата. После три испирања, биотиниловани хумани АЦЕ2 (0.12 уг/мЛ) је додат у јажице, након чега је уследило разблаживање узорака серума и инкубација на 37 степени током 1 сата. За генерисање стандардне криве, анти-САРС-ЦоВ-2 неутрализујуће антитело које је обезбеђено у комплету коришћено је као референца. Плоча је испрана и радни раствор стрептавидин-ХРП је додат у сваки бунар 1 сат на 37 степени. Плоча је затим испрана, а тест је развијен инкубацијом са радним раствором ТМБ супстрата на 37 степени током 20 мин. Реакција је заустављена давањем раствора за заустављање. Апсорбанца је мерена коришћењем ЕЛИСА читача на 450 нм. Компетитивна активност серумских антитела је изражена као одговарајући ниво референтног антитела.
Тест производње цитокина
Одговори Т-ћелија су процењени коришћењем ЕЛИСА цитокина. Спленоцити имунизованих мишева су постављени на плочице са густином од 5×106 ћелија по бунарчићу у 24-плоче. Ћелије су стимулисане са 5 уг/мЛ рекомбинантног САРС-ЦоВ-2 Спике протеина (АЦРОБиосистемс) на 37 степени током 3 дана. Супернатант је сакупљен и тестиран на производњу цитокина. Мишји ИЛ-2, ИЛ-5, ИЛ-13 и ИФН- су квантитификовани помоћу ЕЛИСА помоћу одговарајућег сета антитела (Инвитроген) у складу са упутствима произвођача.
Анимал Цхалленге
Сиријски хрчци (н=8 по групи) су интрамускуларно имунизовани ињекцијом игле са плазмидном ДНК (100 уг/животињи), праћено БТКС електропорацијом као што је горе поменуто. Четири недеље након последње вакцинације, хрчци су интраназално изазвани са 105 ТЦИД50 САРС-ЦоВ-2 (хЦоВ-19/Таиван/4/2020) у 50 μЛ под анестезијом изофлураном. Њихова телесна тежина (н=4 по групи) бележена је сваког дана током 9 дана након изазова. Четири хрчка у свакој групи су жртвована 3. дана након изазова за квантификацију вирусног оптерећења. Да би се одредило вирусно оптерећење у плућима, ткива левог плућа су хомогенизована у 2 мЛ ПБС-а коришћењем гентлеМАЦС® дисоциатора (Милтении Биотец). После центрифугирања на 600 кг током 5 минута, бистрени супернатант је сакупљен за титрацију живог вируса (ТЦИД50 тест) и квантификацију вирусне РНК.
Квантификација оптерећења вирусном РНК
Прочишћени супернатант хомогенизованог ткива левог плућа хрчака заражених САРС-ЦоВ-2- је сакупљен за детекцију вирусног оптерећења. Екстракција РНК је изведена на супернатанту ткива лизираном са ТРИзол ЛС (Амбион), а 10 нг РНК је коришћено као шаблон за РТ-кПЦР реакције. РТ-кПЦР је изведен на КуантСтудио 6 Флек ПЦР систему у реалном времену (АБИ) користећи КАПА ПРОБЕ ФАСТ Универсал Оне-Степ кРТ-ПЦР комплет (КР1282, Роцхе) са прајмерима и сондама специфичним за САРС-ЦоВ-2 (Е_Сарбецо напред: АЦАГГТАЦГТТААТАГТТААТАГЦГТ, Е_Сарбецо назад: АТАТТГЦАГЦАГТАЦГЦАЦАЦА, Е_Сарбецо сонда: ФАМ-АЦАЦТАГЦЦАТЦЦТТАЦТГЦГЦТТЦГ-БХК1) [20].
Предности цистанцхе тубулоса- ојачати имуни систем
Статистичка анализа
Статистички подаци су генерисани коришћењем софтвера ГрапхПад Присм. Статистичка значајност диференцијалних налаза између експерименталних група одређена је двостраним Манн-Вхитнеи тестом. Разлике су се сматрале статистички значајним ако је п-вредност била мања или једнака 0.05.
Резултати
Конструкција плазмида и експресија антигена кандидата за вакцину
Генерисано је пет варијанти САРС-ЦоВ-2 и један конструкт САРС-ЦоВ који садржи различите фрагменте ДНК који кодира протеин шиљака (Слика 1А). Пошто је експресија антигена у снажној корелацији са ефикасношћу вакцине, дизајнирали смо различите фрагменте шиљастог протеина, укључујући РБД (аа319-аа541), РБД до ТМ (аа319-аа1236) или Спике са трансмембранским доменом (ТМ) делеција (аа13-аа1213), са водећом секвенцом активације плазминогена људског ткива (тПА) која може повећати лучење антигена [21]. Домен РБД до ТМ може задржати домен С2 који је важан за формирање структуре са шест спирала за фузију ћелија [22, 23]. Ови конструкти су били следећи: С целе дужине САРС-ЦоВ (пСАРС-С) и САРС-ЦоВ-2 (пСАРС2-С), шиљак пуне дужине са водећом секвенцом ткивног плазминогена активатор (птСАРС2-С), РБД регион (птРБД), РБД на трансмембрански домен (птРБДТМ) и шиљак са делецијом трансмембранског домена (ПТСП). Вектор, пСАРС-С и пСАРС{{10}С су трансфектовани у ћелије ХЕК293Т и експримирани у њима. Ћелијски лизати су анализирани помоћу СДС-ПАГЕ. С пуне дужине се може детектовати на одговарајућој молекулској тежини (Слика 1Б). Варијанта С САРС2-ЦоВ-2 са водећом секвенцом активатора ткивног плазминогена откривена је поликлонским антителом против шиљака. Подаци су показали да је свака варијанта примећена при очекиваној молекулској тежини (Слика 1Ц). Нивои експресије варијанти птСАРС2-С, птРБДТМ и птСдТМ су били слични, док је експресија птРБД била виша у свим варијантама.
Слика 1. Дизајн и експресија САРС-ЦоВ и САРС-ЦоВ-2 варијанти шиљастих конструкција.
(А) Шематски дијаграм САРС-ЦоВ и САРС-ЦоВ-2 варијанте шиљка. тПА, водећа секвенца из ткивног активатора плазминогена; ТМ, трансмембрански домен. (Б, Ц) Вестерн блот анализа спике протеина. ХЕК293Т ћелије су трансфектоване са назначеним плазмидима (векторске, пСАРС-С, пСАРС2-С и С варијанте фузионисане са водећом секвенцом тПА). Ћелијски лизати су сакупљени и испитани антителом против шиљака, а анти- - антитело је коришћено као интерна контрола.
Имуногеност кандидата за вакцину
Да би се испитала имуногеност различитих варијанти, БАЛБ/ц мишевима је интрамускуларно убризгано два пута у 3-недељном интервалу са 100 уг вектора, пСАРС-С и пСАРС2-С, након чега је уследила ин виво електропорација (Слика 2А). Серуми су сакупљени 4. и 6. недеље након прве имунизације. Подаци су показали да серуми пСАРС-С и пСАРС2-С имунизованих животиња могу препознати и С и С2 регионе САРС-ЦоВ-2 пуне дужине са сличним титрима ИгГ антитела (Слика 2Б и 2Ц). Насупрот томе, серуми са пСАРС2-С имунизованих животиња могли би да подигну високе титре анти-РБД (САРС-ЦоВ-2) антитела у 4. и 6. недељи (Слика 2Д), у поређењу са пСАРС-С групом. Сходно томе, серуми пСАРС2-С имунизованих животиња, али не пСАРС-С имунизованих животиња, могли би да неутралишу инфекцију САРС-ЦоВ-2 (Слика 2Е). Геометријски средњи титри (лог2) неутрализујућих антитела у пСАРС2-С имунизационој групи у 4. и 6. недељи били су 9,3 односно 10,3, респективно. Ови резултати су показали да имунизација пСАРС-С не може да изазове унакрсну неутрализацију антитела против САРС-ЦоВ-2 инфекције. РБД-специфична антитела су била критична за неутрализацију активности против САРС-ЦоВ-2 инфекције. С целе дужине САРС-ЦоВ-2 заиста може да изазове високе нивое неутрализујућих титара антитела против САРС-ЦоВ-2 инфекције.
Слика 2. Одговор антитела код мишева након имунизације САРС-ЦоВ и САРС-ЦоВ-2 С ДНК вакцинама.
(А) БАЛБ/ц мишеви (н=4 по групи) су интрамускуларно имунизовани два пута у 3-недељном интервалу са 100 уг назначеног плазмида, након чега је уследила електропорација. Узорци серума су сакупљени у назначеним временским тачкама након прве имунизације. (БД, Ф, Г) Антитела против САРС-ЦоВ-2 шиљастог протеина пуне дужине, С2 региона и РБД процењена су ЕЛИСА тестом. (Е, Х) Неутрализационо антитело изазвано вакцином против САРС-ЦоВ-2 процењено је тестом неутрализације. Титри антитела су представљени као средња вредност ± СЕМ, а титри неутрализације су изражени као геометријска средина са интервалом поверења од 95%. *стр<0.05 by the Mann-Whitney test.
Да бисмо даље истражили да ли замена водеће секвенце може да повећа лучење протеина, користили смо лидерску секвенцу из активатора ткивног плазминогена да спојимо различите варијанте САРС-ЦоВ-2 С протеина. Све варијанте садрже РБД регион САРС-ЦоВ-2 С протеина. После две дозе ДНК имунизације, серуми сакупљени 4. и 6. недеље су анализирани на ИгГ антитела и титре неутрализујућих антитела. Имунизација птСАРС2-С је изазвала веће титре антитела против С протеина пуне дужине у 4. недељи него имунизација птРБД, птРБДТМ и птСдТМ (С1А Сл). Титри анти-РБД антитела имунизације птРБД били су већи од оних код имунизације против птСАРС2-С (1496,2 наспрам 530,9, п=0.057) у 4. недељи (С1Б Сл). Међутим, имунизација птРБД и птСАРС2-С индуковала је сличне нивое неутрализујућих антитела у 4. недељи (С1Ц Фиг). Исти резултати су примећени у анализи серума 6. недеље; птРБД имунизација је изазвала више нивое анти-РБД антитела у поређењу са птСАРС2-С имунизацијом (12589.3 наспрам 1000.0, п=0.028), али исти нивои неутрализујућих антитела (9.3 наспрам 9,6 (лог2)) (Слика 2Ф, 2Г и 2Х). Пошто варијанте спојене са водећом секвенцом тПА нису изазвале веће титре неутрализујућих антитела од пСАРС2-С имунизације, користили смо пСАРС2-С за даље истраживање.
Компетитивно везивање серумских антитела и АЦЕ2 за САРС-ЦоВ-2 РБД
Да бисмо испитали способност серумских антитела да ометају АЦЕ2-РБД интеракцију, извршили смо компетитивни САРС-ЦоВ-2 серолошки тест. У овом тесту, серумска антитела су додата на ЕЛИСА плоче претходно обложене САРС-ЦоВ-2 РБД протеином, након чега је уследио додатак хуманог АЦЕ2 протеина. Специфично неутрализујуће антитело против САРС-ЦоВ-2 РБД је коришћено као референца. Као што је приказано уСлика 3, серумска антитела пСАРС2-С имунизованих мишева везала су се за РБД и блокирала везивање АЦЕ2, што је било еквивалентно приближно 353 уг/мЛ референтног антитела, док је пСАРС-С серум био еквивалентан 56 уг/мЛ референтног антитела. Према томе, наши подаци сугеришу да би имунизација пСАРС2-С могла да изазове компетитивна антитела која ефикасно блокирају везивање САРС-ЦоВ-2 РБД-а за АЦЕ2 рецептор. Овај резултат је био у складу са ЕЛИСА титром против САРС-ЦоВ2 РБД (Слика 2Д), а подржано је студијом о разлици РБД секвенци између САРС-ЦоВ и САРС-ЦоВ-2 [24].
Слика 3. Компетитивна активност имунизованих мишјих серума против РБД/АЦЕ2 интеракције.
БАЛБ/ц мишеви (н=4 по групи) су интрамускуларно имунизовани два пута у 3-недељном интервалу са 100 уг вектора, пСАРС-С или пСАРС2-С, након чега је уследила електропорација. Узорци серума су сакупљени 8. недеље након прве имунизације. Серумска антитела која се такмиче са АЦЕ2 за везивање РБД процењена су компетитивним САРС-ЦоВ-2 серолошким тестом. Компетитивна активност мишјих серума се изражава као еквивалентни ниво антитела на РБД (САРС-ЦоВ-2 спике протеин) (референтно антитело). Титри антитела су представљени као средња вредност ± СЕМ. *стр<0.05 by the Mann-Whitney test.
Дугорочни хуморални имунитет изазван САРС-ЦоВ-2 С ДНК вакцином и понуђена унакрсна заштита против САРС-ЦоВ-2 са мутацијом Д614Г
Посебно, дуготрајно одржавање титра ИгГ антитела против С пуне дужине примећено је 20 недеља након прве имунизације (Слика 4А). Титри геометријске средине (лог2) за САРС-ЦоВ-2 неутрализујуће антитело достигли су 10,8 у 8. недељи након пСАРС2-С имунизације, благо се смањивши на 9,1 у 12. и на 8,8 у 20. недељи (Слика 4Б). Ови резултати сугеришу да имунизација пСАРС2-С даје дуготрајан хуморални одговор на САРС-ЦоВ-2. Штавише, пСАРС2-С ДНК вакцина са генотипом Д614 изазвала је неутрализујући одговор антитела против вируса који садржи мутацију Д614Г (Слика 4Ц), што је слично титрима неутрализације против генотипа Д614. Према томе, пСАРС2-С може да пружи унакрсну заштиту од најраспрострањеније и доминантније Д614Г варијанте САРС-ЦоВ-2.
Слика 4. САРС-ЦоВ-2 С ДНК вакцина је изазвала дугорочни хуморални имунитет и унакрсну заштиту против САРС-ЦоВ-2 са мутацијом Д614Г.
БАЛБ/ц мишеви (н=4 по групи) су интрамускуларно имунизовани три пута у 3-недељном интервалу са 100 уг вектора, пСАРС-С или пСАРС2-С, након чега је уследила електропорација. Узорци серума су сакупљени у назначеним временским тачкама након прве имунизације. (А) Антитела против САРС-ЦоВ-2 протеина пуне дужине процењена су ЕЛИСА тестом. (Б, Ц) Неутрализујућа активност изазвана вакцином против САРС-ЦоВ-2 са генотиповима Д614 или Г614 процењена је тестом неутрализације. Титри антитела су представљени као средња вредност ± СЕМ, а титри неутрализације су изражени као геометријска средина са интервалом поверења од 95%. *стр<0.05 by the Mann-Whitney test.
Индукција Тх1- Или Тх2-пристрасних одговора
Ефекторске ЦД4+ Т ћелије се могу поделити у две главне функционалне подгрупе, Тх1 и Тх2, на основу излучених цитокина након активације. Тх1 ћелије производе инфламаторне цитокине (ИФН-) и учествују у ћелијски посредованим имуним одговорима на интрацелуларне бактерије и вирусе, док Тх2 ћелије луче углавном помажу Б ћелијама да производе антитела, али такође подстичу имунитет посредован еозинофилима (ИЛ-5 и ИЛ{ {9}}), што доводи до хуморалних или алергијских одговора [25, 26]. Штавише, механизми зависни од Тх2 ћелија могу допринети појачаној респираторној болести (ВАЕРД) повезаној са вакцином, као што показују студије кандидата за вакцину против САРС-ЦоВ [27, 28], који наглашавају да је уравнотежен одговор Т ћелија кључан за безбедан развој ЦОВИД{0}} вакцине [29]. Да би се решио овај проблем, БАЛБ/ц и Ц57БЛ/6 мишеви су имунизовани вектором, пСАРС-С и пСАРС2-С два пута у 3-недељном интервалу. Мишеви су жртвовани 7 дана након друге имунизације, а спленоцити су стимулисани САРС-ЦоВ-2 С протеином (5 уг/мЛ) током 3 дана. Код БАЛБ/ц мишева (Слика 5А–5Д), секреција цитокина Тх1 типа ИФН- (19641,3 пг/мЛ ± 8823,5) и ИЛ-2 (599,5 пг/мЛ ± 37,7) је била висока након стимулације са С протеином у пСАРС2-С имунизационе групе, али су откривени веома ниски нивои цитокина Тх2 типа ИЛ-5 (18,1 пг/мЛ ± 11,8) и ИЛ-13 (567,2 пг/мЛ ± 166,2). Слични резултати су примећени код Ц57БЛ/6 мишева, пСАРС2-С група за имунизацију је изазвала већу количину ИФН- (33918,8 пг/мЛ ± 11646,1) и ИЛ-2 (800,3 пг/мЛ ± 109,5) од оне од ИЛ-5 (4,6 пг/мЛ ± 2,9) и ИЛ-13 (545,7 пг/мЛ ± 117,4) (Слика 5Е–5Х). Ови подаци сугеришу да пСАРС2-С може да изазове Тх1-пристрасне имуне одговоре.
Слика 5. Одговор Т ћелија код мишева после имунизације пСАРС-С и САРС2-С ДНК вакцинама.
БАЛБ/ц (АД) и Ц57БЛ/6 (ЕХ) мишеви (н=4 по групи) су интрамускуларно имунизовани два пута у 3-недељном интервалу са 100 уг вектора, пСАРС-С или пСАРС{{ 8}}С, након чега следи електропорација. Спленоцити су сакупљени 4. недеље након прве имунизације, а нивои излученог ИФН- (А, Е), ИЛ-2 (Б, Ф), ИЛ-5 (Ц, Г) и ИЛ -13 (Д, Х) су процењени након рестимулације рекомбинантним САРС-ЦоВ-2 С протеином. Титри антитела су представљени као средња вредност ± СЕМ. *стр<0.05 by the Mann-Whitney test.
Профилактичка ефикасност ДНК вакцина против САРС-ЦоВ-2 изазова
Да би се истражила заштитна ефикасност вакцинације против пСАРС2-С, сиријски хрчци су два пута имунизовани са 100 уг ДНК у 3-недељном интервалу и интраназално изазвани вирусом САРС-ЦоВ-2 7. недеље (Слика 6А). После имунизације, серуми 4. и 6. недеље су сакупљени за анализу титра антитела (ИгГ) и неутрализујућих антитела. Имунизација пСАРС2-С је изазвала више нивое титара анти-Спике антитела од птРБД имунизације у недељи 4 (1584,9 наспрам 50,1) и недељи 6 (1995,3 наспрам 63,1) код хрчака (Слика 6Б). У складу са титрима анти-Спике антитела, серуми пСАРС2-С-имунизованих хрчака подигли су веома високе титре неутрализујућих антитела (6,5 у недељи 4 и 6,4 у недељи 6 (лог2)), али серуми вектора или птРБД имунизовани хрчци нису (Слика 6Ц). После изазова са САРС-ЦоВ-2, телесна тежина хрчка је праћена сваког дана. Претходне студије су откриле да је вирусни титар у плућима хрчка достигао висок ниво 3 дана након изазивања [30]. Према томе, половина хрчака из сваке групе је жртвована трећег дана и анализирано је вирусно оптерећење у плућима. Телесна тежина векторски вакцинисаних хрчака се постепено смањивала, а проценат изгубљене телесне тежине био је 11,1% 6 дана након изазивања. Насупрот томе, пСАРС2-С имунизација штитила је хрчке од губитка телесне тежине (Слика 6Д). Штавише, титри инфективног вируса и број копија вирусне РНК у групи пСАРС2-С показали су смањење од 2,29 и 1,37 лог10 у поређењу са контролном групом вектора (Слика 6Е и 6Ф). Ови резултати сугеришу да имунизација пСАРС2-С пружа заштиту од инфекције САРС-ЦоВ-2 код сиријских хрчака.
Слика 6. Профилактичка ефикасност САРС-ЦоВ-2 С ДНК вакцине код САРС-ЦоВ-2-заражених хрчака.
(А) Временски ток ДНК вакцинације и САРС-ЦоВ-2 изазова. Сиријски хрчци су интрамускуларно имунизовани два пута у 3-недељном интервалу са 100 уг контроле, пСАРС-С или пСАРС2-С, након чега је уследила електропорација. Узорци серума су сакупљени ретроорбиталним узорковањем крви у недељама 4 и 6 након прве имунизације. 4 недеље након друге имунизације, сиријски хрчци су интраназално изазвани са 105 ТЦИД50 САРС-ЦоВ-2. (Б) Антитела против САРС-ЦоВ-2 протеина пуне дужине процењена су ЕЛИСА тестом. (Ц) Неутрализујућа активност изазвана вакцином против САРС-ЦоВ-2 процењена је тестом неутрализације. (Д) Промена телесне тежине (%) хрчака је забележена сваког дана након изазивања САРС-ЦоВ-2. Титри вируса (Е) и копије вирусне РНК (Ф) у плућима хрчака заражених САРС-ЦоВ-2- 3 дана након изазивања одређени су ТЦИД50 тестом и кРТ-ПЦР, респективно. Титри антитела су представљени као средња вредност ± СЕМ, а титри неутрализације су изражени као геометријска средина са интервалом поверења од 95%. *стр<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.
Дискусија
Покренуто је више од 80 клиничких испитивања вакцине ЦОВИД{1}}, а студије имуногености и вирусних изазова на животињама су кључни кораци у процесима развоја вакцине. ДНК вакцине за инфекцију САРС-ЦоВ-2 интензивно се развијају за различите приступе испоруке. Електропорација је обећавајући приступ који може побољшати испоруку ДНК и антигеност имуногена ин виво. Две студије ДНК вакцине су објављене од стране Иу ет ал. [13] и Смитх ет ал. [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >3.1 лог10 смањења вирусног оптерећења у бронхоалвеоларном испирању након изазивања у поређењу са контролама. Смитх ет ал. открили су да имунизација мишева и замораца са ИНО-4800 (кодирањем С протеина пуне дужине) са електропорацијом може изазвати неутрализирајућа антитела против САРС-ЦоВ-2 инфекције и блокирати везивање С протеина за АЦЕ2 рецептор, али јесте не пружа податке о изазовима животиња. У овом извештају смо проценили различите варијанте за кандидате за ДНК вакцину и открили да је С протеин пуне дужине (пСАРС2-С) најпогоднији за даљу имунолошку студију. Иако САРС-ЦоВ и САРС-ЦоВ-2 деле 76% хомологије у својим С протеинима [31, 32], пСАРС-С имунизација не може да изазове антитела против РБД протеина САРС-ЦоВ-2 С или неутралише титар антитела против инфекције САРС-ЦоВ-2 (Слика 2). Заиста, анти-РБД антитела играју важну улогу у блокирању вирусне инфекције. Међутим, имунизација само са РБД (птРБД) створила је високе титре неутрализујућих антитела код мишева, али не и код хрчака (сл.2Hи6C). Спекулисали смо да овај резултат може бити последица тога што сигнални пептид (активатор ткивног плазминогена) није успео да олакша лучење РБД протеина код хрчака. Детаљан механизам захтева даље проучавање у будућности. Такође смо приметили да је птРБДТМ (кодирање фрагмента из РБД у трансмембрански домен С) имунизација изазвала ниже титре неутрализујућих антитела од птРБД имунизације (сл.2HиS1C). Резултати могу одражавати нестабилну структуру РБД-ТМ протеина. Да би се даље истражили Тх1/Тх2 имуни одговори, спленоцити имунизованих мишева су стимулисани САРС-ЦоВ-2 С протеином. Открили смо да пСАРС2-С имунизација изазива јаке Тх1-пристрасне имуне одговоре са вишим нивоима лучења ИФН- - након стимулације (Слика 5), али пСАРС-С имунизација је изазвала само ниске нивое лучења ИФН{1}}. Ови подаци указују да унакрсна реактивност одговора Т ћелија између шиљастог протеина САРС-ЦоВ и САРС-ЦоВ-2 није висока (Слика 5). Штавише, ИФН-ЕЛИСПОТ тест је открио да је мање одговора Т ћелија откривено на С1 регион код Ц57БЛ/6 и БАЛБ/ц мишева имунизованих са пСАРС-С (С2 Сл), што је такође подржано Смитовом студијом [12]. Ови подаци указују на то да вакцина против САРС-а можда неће пружити пуну заштиту од инфекције САРС-ЦоВ-2. Развој ДНК вакцина је важан за брз одговор на пандемијску инфекцију коронавирусом. Дакле, успех ДНК вакцине против САРС-ЦоВ-2 могао би се применити на друге хитне заразне болести.
Различити конструкти коришћени у САРС-СоВ-2 ДНК вакцинама изазвали су различите нивое неутрализујућих титара антитела. Водећа секвенца тПА је коришћена за повећање експресије и секреције антигена у ДНК вакцинама [21, 33–35]. Међутим, тПА водећа секвенца није значајно повећала титре антитела у овом извештају. Да би се додатно повећала ефикасност вакцине, различите лидерске секвенце би се могле користити за замену природне лидерске секвенце шиљастог протеина. ИгЕ лидер секвенца је коришћена у ИНО-4800 ДНК вакцини и МЕРС-ЦоВ вакцини [5, 12]. Поред тога, модификована секвенца шиљастог протеина такође може повећати имуногеност вакцине. Стабилизовани шиљасти протеин је дизајниран мутирањем фуринског места и других региона како би се створила префузиона структура (С-2П) која може повећати експресију шиљастог протеина ~10-пут [36]. Идеална ДНК вакцина треба да оптимизује конструкцију плазмидне ДНК и систем испоруке како би повећала ниво експресије протеина.
цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем
Животињски модели су критични за развој вакцине против ЦОВИД-19. Неколико животињских модела је коришћено за процену ефикасности вакцина против ЦОВИД-19, укључујући примате који нису људи [13, 37], хумани АЦЕ2 трансгени мишеви [38] и сиријски хрчци [39]. АЦЕ2 сиријског хрчка има велику сличност са хуманим АЦЕ2, а његов афинитет везивања за С протеин САРС-ЦоВ-2 је предвиђен већи од мишјег АЦЕ2 [40]. Ово је разлог зашто су људски АЦЕ2 трансгени мишеви коришћени као модели изазивања САРС-ЦоВ-2, али не и мишеви дивљег типа. Студије преноса САРС-ЦоВ-2 показале су да вирус може ефикасно да инфицира наивне хрчке директним контактом или путем аеросола [41]. Интраназална инфекција САРС-ЦоВ-2 може да се реплицира и изазове патогенезу у плућима сиријских хрчака [30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>смањење од 5% у односу на почетну вредност), што је било повезано са дужим трајањем болести [42]. Ови налази указују на то да је сиријски хрчак такође погодан животињски модел за процену ЦОВИД-19 вакцина. На основу доступности животињских модела, изабрали смо хрчке као изазовни модел САРС-ЦоВ-2 да бисмо проценили ефикасност вакцине. Наши подаци су показали да имунизација пСАРС2-С, али не и птРБД, може да изазове високе титре анти-Спике ИгГ антитела и титре неутрализујућих антитела (Слика 6Б и 6Ц). Сходно томе, пСАРС2-С-имунизовани хрчци, али не и птРБД-имунизовани хрчци, генерисали су имуни одговор против САРС-ЦоВ-2 изазова. Приметили смо да птРБД имунизација може да изазове високе нивое неутрализујућих титара антитела код мишева, али не и код хрчака. Конфликтни резултати могу бити зато што сам РБД није стабилно изражен код хрчака. Модел хрчка је такође коришћен за процену векторске вакцине ЦОВИД-19 засноване на аденовирусу серотипа 26 (Ад26). Једна имунизација вакцином заснованом на вектору Ад26 која експримира стабилизовани САРС-ЦоВ-2 шиљасти протеин који је изазвао неутралишуће реакције антитела и заштитио од САРС-ЦоВ-2 инфекције изазвала је губитак тежине, делимичну смртност и репликацију вируса у плућима [39]. Ови резултати су показали да је модел хрчка погодан за процену ефикасности вакцина против ЦОВИД-19.
Велики број напора у развоју вакцине против САРС-ЦоВ{1}} заснован је на истраживачком искуству МЕРС-ЦоВ и САРС-ЦоВ. Глобално, неколико ЦОВИД-19 вакцина је одобрено за хитну употребу у децембру 2020, укључујући вакцине ЦОВИД-19 засноване на РНК и аденовирусним векторима. Разговарало се о предностима и недостацима различитих платформи за вакцине [43]. Векторске вакцине против аденовируса могу изазвати јачи имуни одговор од ДНК и мРНА вакцина, али њихова ефикасност вакцине може бити смањена кроз постојећи имунитет против Ад вектора [44]. У поређењу са ДНК вакцином, мРНА вакцини је потребна ултраниска температура за складиштење и транспорт [45]. Дакле, ДНК вакцина би могла бити потенцијална платформа за вакцину, посебно током хитне употребе.
Наша студија сугерише могућност ДНК вакцине за људску употребу. Даље студије би могле да испитају ефикасност ове ДНК вакцине која се испоручује коришћењем интрадермалне (ИД) ињекције, што је погодније за клиничку примену, јер је игла за ИМ ињекцију дубока око 18 мм код људи и утиче на више ткива него ИД ињекција ЕП. Штавише, ефикасност вакцине треба да се тестира на остарелим мишевима као моделу за старије људе, јер је ова популација посебно тешко погођена када је заражена САРС-ЦоВ-2. Претходне студије су показале да је одговор Тх2 ћелија повезан са појачаном респираторном болешћу (ВАЕРД) након вакцинације инактивираних вирусних вакцина против РСВ [46], вирус малих богиња [47] и САРС-ЦоВ [27, 48]. Насупрот томе, пријављени су мање озбиљни случајеви САРС-ЦоВ који су резултат индукције Тх1 ћелијског одговора [49]. Стога, јаки Тх{0}}пристрасни имуни одговори изазвани ДНК вакцином сугеришу да нежељени ефекти вероватно неће бити велики проблем [50]. Осим тога, забринутост у вези са вакцинама на бази протеина је повећана због употребе адјуванса типа алуминијумске соли или емулзије уља у води, који доводе до Тх{4}}пристрасног имунолошког одговора и повећавају потенцијалне нежељене ефекте [51, 52]. Укратко, ЦОВИД-19 ДНК вакцина би могла да игра главну улогу у контроли пандемије ЦОВИД-19 у блиској будућности.
Референце
- Пак А, Адегбоие ОА, Адекунле АИ, Рахман КМ, МцБриде ЕС, Еисен ДП. Економске последице епидемије ЦОВИД{0}}: Потреба за спремношћу за епидемију. Фронт Публиц Хеалтх. 2020;8:241. пмид:325743072. Центар за системске науке и инжењерство (ЦССЕ) [Интернет]. ЦОВИД-19 контролна табла. Универзитет Џонс Хопкинс. [цитирано 11. фебруара 2021.]. Доступно од:
- 3.Буцххолз УЈ, Букреиев А, Ианг Л, Ламиранде ЕВ, Мурпхи БР, Суббарао К, ет ал. Допринос структурних протеина корона вируса тешког акутног респираторног синдрома заштитном имунитету. Проц Натл Ацад Сци УС А. 2004;101(26):9804–9. пмид:15210961
- 4. Ианг ЗИ, Конг ВП, Хуанг И, Робертс А, Мурпхи БР, Суббарао К, ет ал. ДНК вакцина изазива неутрализацију САРС коронавируса и заштитни имунитет код мишева. Природа. 2004;428(6982):561–4. пмид:15024391
- 5. Мутхумани К, Фалзарано Д, Реусцхел ЕЛ, Тингеи Ц, Флингаи С, Вилларреал ДО, ет ал. Синтетичка консензус ДНК вакцина против протеина шиљака индукује заштитни имунитет против коронавируса блискоисточног респираторног синдрома код нељудских примата. Сци Трансл Мед. 2015;7(301):301ра132. пмид:26290414
- 6. Краммер Ф. САРС-ЦоВ-2 вакцине у развоју. Природа. 2020;586(7830):516–27. пмид:32967006
- 7. Кхалај-Хедаиати А. Заштитни имунитет против кандидата за подјединичну вакцину против САРС-а на основу шиљастог протеина: лекције за развој вакцине против коронавируса. Ј Иммунол Рес. 2020;2020:7201752. пмид:32695833
- 8.Лу Б, Тао Л, Ванг Т, Зхенг З, Ли Б, Цхен З, ет ал. Хуморални и ћелијски имуни одговори изазвани 3а ДНК вакцинама против тешког акутног респираторног синдрома (САРС) или коронавируса сличног САРС-у код мишева. Цлин Ваццине Иммунол. 2009;16(1):73–7. пмид:18987164
- 9. Бовер ЈФ, Ианг Кс, Содроски Ј, Росс ТМ. Издвајање неутрализујућих антитела са ДНК вакцинама које експримирају растворљиве стабилизоване тримере гликопротеина омотача вируса хумане имунодефицијенције типа 1 коњуговане са Ц3д. Ј Вирол. 2004;78(9):4710–9. пмид:15078953
- 10. Закхартцхоук АН, Висванатхан С, Мосхинскии И, Петриц М, Бабиук ЛА. Оптимизација ДНК вакцине против САРС-а. ДНК Целл Биол. 2007;26(10):721–6. пмид:17665998
- 11.Гари ЕН, Веинер ДБ. ДНК вакцине: ударно време је сада. Цурр Опин Иммунол. 2020;65:21–7. пмид:32259744
- 12. Смитх ТРФ, Пател А, Рамос С, Елвоод Д, Зху Кс, Иан Ј, ет ал. Имуногеност кандидата за ДНК вакцину за ЦОВИД-19. Нат Цоммун. 2020;11(1):2601. пмид:32433465
- 13. Иу Ј, Тостаноски ЛХ, Петер Л, Мерцадо НБ, МцМахан К, Махрокхиан СХ, ет ал. Заштита ДНК вакцине против САРС-ЦоВ-2 код резус макака. Наука. 2020;369(6505):806–11. пмид:32434945
- 14.Јорритсма СХТ, Гованс ЕЈ, Грубор-Баук Б, Вијесундара ДК. Методе испоруке за повећање ћелијске апсорпције и имуногености ДНК вакцина. Вакцина. 2016;34(46):5488–94. пмид:27742218
- 15. Кудцходкар СБ, Цхои Х, Реусцхел ЕЛ, Ескуивел Р, Јин-Ах Квон Ј, Јеонг М, ет ал. Брз одговор на заразну болест у настајању—Лекције научене из развоја синтетичке ДНК вакцине која циља на Зика вирус. Микроби инфицирају. 2018;20(11–12):676–84. пмид:2955534516. Адам Л, Тцхитцхек Н, Тодорова Б, Росенбаум П, Јоли Ц, Поук Ц, ет ал. Урођени молекуларни и ћелијски потпис у кожи који претходи дуготрајним одговорима Т ћелија након вакцинације електропорацијом ДНК. Ј Иммунол. 2020;204(12):3375–88. пмид:32385135
- 17. Лин Ф, Схен Кс, МцЦои ЈР, Мендоза ЈМ, Иан Ј, Кеммеррер СВ, ет ал. Нови прототип уређаја за испоруку ДНК вакцине побољшане електропорацијом истовремено на кожу и мишиће. Вакцина. 2011;29(39):6771–80. пмид:21199706
- 18. Виллиамс М, Евинг Д, Блевинс М, Сун П, Сундарам АК, Равипракасх КС, ет ал. Повећана имуногеност и заштитна ефикасност тетравалентне ДНК вакцине против денга вируса коришћењем електропорације и интрадермалне испоруке. Вакцина. 2019;37(32):4444–53. пмид:31279565
- 19. Рамакрисхнан МА. Одређивање титра крајње тачке од 50% коришћењем једноставне формуле. Свет Ј Вирол. 2016;5(2):85–6. пмид:27175354
- 20. Цорман ВМ, Ландт О, Каисер М, Моленкамп Р, Меијер А, Цху ДК, ет ал. Откривање новог коронавируса из 2019. (2019-нЦоВ) помоћу РТ-ПЦР у реалном времену. Еуро Сурвеилл. 2020. пмид:31992387
- 21. Коу И, Ксу И, Зхао З, Лиу Ј, Ву И, Иоу К, ет ал. Сигнална секвенца активатора ткивног плазминогена (тПА) повећава имуногеност вакцине против туберкулозе засноване на МВА. Иммунол Летт. 2017;190:51–7. пмид:28728855
- 22. Ксиа С, Зху И, Лиу М, Лан К, Ксу В, Ву И, ет ал. Механизам фузије 2019-нЦоВ и инхибитора фузије који циљају ХР1 домен у спике протеину. Целл Мол Иммунол. 2020;17(7):765–7. пмид:32047258