1. ДЕО Антиоксидативни и антикоагулантни ефекти фенилпропаноидних гликозида изолованих из брумрапа (Оробанцхе Цариопхиллацеа, Пхелипанцхе Аренариа и П. Рамоса)

Бартош Скалски а, Силвиа Павелец б, Дариусз Једрејек б, Агата Ролник а, Ростислав Пиетукхов а,

Рената Пивоварцзик ц, Анна Стоцхмал б, Беата Олас а,*

а Универзитет у Łо´д´з-у, Одсек за општу биохемију, Факултет за биологију и заштиту животне средине, 90-236 Ł´од´з, Пољска

б Одељење за биохемију и квалитет усева, Институт за науку о земљишту и узгој биљака, Државни истраживачки институт, 24-100 Пулави, Пољска

Центар за истраживање и очување биодиверзитета, Одсек за биологију животне средине, Институт за биологију, Универзитет Јан Коцхановски, 25-406 Киелце, Пољска

Апстрактан

Холопаразитске биљке Оробанцхацеае, укључујућиЦистанцхе, Оробанцхе и Пхелипанцхе спп, познати су по свом богатству фенилпропаноидних гликозида (ППГ). Утврђено је да многа ППГ једињења поседују широк спектар активности, као што су антимикробна, антиинфламаторна, антиоксидативна и побољшавају памћење. Да бисмо боље истражили потенцијал биоактивности европске метлице (О. Цариопхиллацеае – ОЦ, П. Аренариа – ПА, П. рамоса – ПР) и десет појединачних изолованих фенилпропаноидних састојака, истражили смо њихово антирадикално дејство, заштитни ефекат од оксидације у плазми ин витро систему. , и утицај на параметре коагулације. Тестирани екстракти су показали активност чишћења од 50–70 процената Тролок-ове моћи. Екстракт ОЦ, богат саактеозид, имао је преко 20 процената бољи антирадикални потенцијал од ПР екстракта који је једини садржао ППГ без Б-прстена катехолног дела у ацил јединици. Штавише, откривено је да је само осам тестираних ППГ-а показало антиоксидативни потенцијал у људској плазми третираној са Х2О2/Фе; међутим, три тестирана ППГ-а поседовала су и антикоагулантни потенцијал поред антиоксидативних својстава. Чини се да је структура ППГ, посебно присуство ацилних и катехолних делова, углавном повезана са њиховим антиоксидативним својствима. Антикоагулантни потенцијал ових једињења је такође повезан са њиховом хемијском структуром. Одабрани ППГ показују потенцијал за лечење кардиоваскуларних болести повезаних са оксидативним стресом.

За више информација контактирајте:Joanna.jia@wecistanche.com

Цистанцхетубулоза има много ефеката

1. Представљање

Оксидативни стрес је надалеко познат по свом негативном утицају на здравље живих организама, укључујући убрзано старење и неке врсте рака. Појава оксидативног стреса повезана је са поремећеном равнотежом између оксидативних и антиоксидативних механизама (укључујући ензимску (каталаза, глутатион пероксидаза) и неензимску (глутатион) одбрану) у ћелијама организма [1]. Прекомерна производња реактивних врста кисеоника (РОС), укључујући оксидирајуће радикале и врсте затворене љуске, један је од главних механизама иза формирања оксидативног стреса. Међутим, биолошки ефекат изазван РОС у великој мери зависи од концентрације, времена излагања и локације. У нормалним условима (ниска концентрација), радикали кисеоник/азот могу да играју улогу секундарних гласника, али на вишем нивоу могу да почну да реагују са биолошким структурама, као што су ћелијске мембране [2]. Међу свим врстама РОС, хидроксилни радикал (ХО.) узрокује једну од највећих оштећења био-макромолекула: протеина, липида и ДНК. Познато је да оксидативни стрес игра важну улогу у низу болести, укључујући кардиоваскуларне. Поремећаји крвног система су у корелацији и/или претходили променама различитих параметара хемостазе и биомаркера у плазми [1,3].

С друге стране, многе природне супстанце, као што су полифеноли и полинезасићене масне киселине, идентификоване су као моћни антиоксиданси способни да спрече стварање и/или смање реактивне врсте кисеоника. Једињења са таквим својствима налазе се у многим прехрамбеним производима и фармацеутским препаратима биљног порекла. Исхрана обогаћена свежим поврћем и воћем и антиоксидативне терапије засноване на природним антиоксидансима се стога широко препоручују јер могу смањити ниво оксидативног стреса и спречити различите патофизиолошке процесе [4,5]. Биљни полифеноли су разноврсна група секундарних метаболита, међу којима значајно место заузимају фенолне киселине, пошто су широко распрострањене и испољавају разноврсна биолошка дејства, као што су антимикробна, антиоксидативна и антиинфламаторна. Фенилпропаноидни гликозиди (ППГ) су естарски десродници хидроксициметне киселине и они су главна/једина класа секундарних метаболита присутних у холопаразитским биљкама Оробанцхацеае, укључујућиЦистанцхе, Оробанцхе и Пхелипанцхе спп. Неколико врста ове породице су озбиљне штеточине усева којих фармери желе да се отарасе на њивама (пример Пхелипанцхе рамоса), неколико се користи у фармакологији, док је већина од малог значаја за људе. ХербаЦистанцхесе у великој мери користи у азијској традиционалној медицини у лечењу недостатка бубрега и као средство за побољшање имунитета и памћења, против старења и умора [6]. Фитокемијске анализе различитих истраживачких група су показале да су фенилпропаноидни гликозиди, као што су ацетонид, ехинакозид и подијумска страна, један од главних активних састојака Херба Цистанцхе [7]. Недавна студија о неколико врста метлића пронађених у Пољској од стране Једрејек ет ал. [8] је показао да овај биљни материјал има сличан квалитативни састав (доминација ППГ), штавише, једнак је или чак превазилазиЦистанцхеспп. у погледу садржаја активних супстанци [8].

Цистанцхе десертицола има много ефеката, кликните овде да бисте сазнали више

Ова студија је имала за циљ да процени антирадикални и антиоксидативни потенцијал, као и утицај на параметре хемостазе три екстракта метличке репице (Оробанцхе Цариопхиллацеае – ОЦ, Пхелипанацхе Аренариа – ПА и П. рамоса – ПР) богата различитим фенилима. -

простаноиди, као и њихови појединачни ППГ састојци. Антирадикални капацитет је мерен коришћењем 2,2′-азинобис-3-етилбензтиазолин-6-сулфонске киселине/Тролок еквивалента (АБТС/ТЕ) и 2,2-дифенил-1-пикрилхибразила (ДППХ ) тестови. Оксидативни стрес у плазма тест систему индукован је коришћењем хидроксилног радикала (Х2О2/Фе), затим липидне пероксидације (тест реактивних врста тиобарбитурне киселине (ТБАРС)) и мерен је ниво протеинских карбонилних и тиолних група. Међу утврђеним параметрима хемостазе били су: активирано парцијално тромбопластинско време (АПТТ), протромбинско време (ПТ) и тромбинско време (ТТ).

2. Материјал и методе

2.1. хемикалије

2,2-дифенил-1-пикрилхидразил радикал (ДППХ), 2,2′-азинобис-3-етилбензтиазолин-6-сулфонска киселина (АБТС), калијум персулфат, {{9 }}хидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксилна киселина (Тролок), диметилсулфоксид (ДМСО), тиобарбитурна киселина (ТБА), мравља киселина (ЛЦ-МС степен), и Х2О2 су набављени од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, МО, САД). Метанол (ХПЛЦ градијент квалитета) и ацетонитрил (ЛЦ-МС граде) су набављени од Мерцк (Дармстадт, Немачка). Десет фенил-

пропаноична једињења тестирана у овом раду, укључујући 2′-О-ацетилактеозид (97 процената), 2′-О-ацетилполиумозид (98 процената), 3-О-метилполиумозид (96 процената), ацетонид (99 процената), арену изнутра (97 процената), кренатозид (98 процената), тенипозид (99 процената), полиумозид (99 процената), тубулозид А (96 процената) и видеманиозид Д (96 процената) смо претходно изоловали из ниже наведеног биљног материјала [ 8]. Чистоћа једињења је процењена коришћењем УХПЛЦ-ПДА-МС анализе. Ултрачиста вода је припремљена у компанији користећи Милли-К систем за пречишћавање воде (Миллипоре Цо.). Остали реагенси су били аналитичког квалитета и обезбеђени су од домаћих комерцијалних добављача.

2.2. Садни материјал

Цвјетнице три врсте метличке репице, укључујући Оробанцхе Цариопхиллацеае См., Пхелипанцхе Аренариа Помел и П. Рамос (Л.) Помел идентификовао је проф. Рената Пивоварцзик (Универзитет Јан Коцхановски, Киелце, Пољска) и сакупљена из природног извора у Пољској.

Ваучерски примерци (О. Цариопхиллацеае – Цхоменто´век (50,3349◦Н, 20,4000◦Е), ксеротермни травњак, паразитира Галиум бореале, мај 2014; П. Аренариа – Звиерзиниец),◦2. угар, паразитира Артемисиа цампестрис, јун 2014;

П. рамоса – Сзевце (50,3553◦Н, 22,3038◦Е), поље, паразити Соланум Лицоперсицум, септембар 2014) депоновани су у Хербаријуму Универзитета Јан Коцхановски у Киелцеу (КТЦ). Биљни материјал је лиофилизован и фино млевен пре екстракције.

2.3. Припрема екстракта метлића

Биљни материјал у праху (О. Цариопхиллацеае (ОЦ) – 2 г, П. Аренариа (ПА) – 3 г и П. рамоса (ПР) – 3 г) екстрахован је са 80 процената МеОХ на 40 ◦Ц и 1500 пси (притисак растварача ) коришћењем убрзаног АСЕ 200

екстрактор растварача (Дионек, Суннивале, ЦА, УСА). Екстракти су упарени и осушени замрзавањем (Гамма 2–16 ЛСЦ замрзивач за сушење, Цхрист, Немачка). Ефикасност екстракције за ОЦ, ПА и ПР била је 55 процената, 37 процената и 43 процента по тежини биљног материјала, респективно. Због високог садржаја угљених хидрата (подаци нису приказани), сирови екстракти су даље пречишћени екстракцијом чврсте фазе (СПЕ) на Оасис ХЛБ микро колони (500 мг; Ватерс, Милфорд, МА, САД). Шећери су уклоњени са 1% МеОХ, а затим су једињења од интереса елуирана са 80% МеОХ. Након уклањања растварача, екстракти ОЦ, ПА и ПР су лиофилизовани (Гамма 2–16 ЛСЦ сушач смрзавањем), а приноси пречишћавања СПЕ били су 53 процента (ОЦ), 67 процената (ПА) и 51 проценат (ПР) .

2.4. Фитокемијске карактеристике екстракта метличке репице

Квалитативне и квантитативне анализе екстракта метличке репице вршене су коришћењем АЦКУИТИ УПЛЦ система (Ватерс) повезаног са детектором фотодиодног низа (ПДА) и тандем квадруполним масеним спектрометром (ТКД-МС/МС). Лиофилизирани екстракти ОЦ, ПА и ПР растворени су у 50 процената метанола у концентрацији од 0,50 мг/мЛ, а затим

хроматографисан на БЕХ Ц18 колони (100 × 2,1 мм, 1,7 µм, Ватерс). Услови хроматографије су били следећи: температура рерне – 25 ◦Ц,

линеарни градијент 10→25 процената мобилне фазе Б (0.1 проценат мравље киселине у ацетонитрилу) у мобилној фази А (0.1 проценат мравље киселине у Х2О) преко 12 мин, брзина протока – 0,4 мЛ/мин, запремина убризгавања – 2 μЛ, УВ опсег – 190–490 нм (резолуција 3,6 нм). МС анализа је изведена у режиму негативних јона са електроспреј јонизацијом (ЕСИ), уз коришћење следећих подешавања: опсег скенирања 100–1200 м/з; капиларни напон 2,8 кВ; напон конуса 35 В;

температура извора 150 ◦Ц; температура десолватације 450 ◦Ц; десолвација

проток гаса 900 Л/х, а проток конусног гаса 100 Л/х. Прикупљање и обрада података обављени су коришћењем софтвера Ватерс МассЛинк 4.1.

Пикови фенилпропаноидног гликозида (ППГ) идентификовани су поређењем добијених ЛЦ-МС података са претходно изолованим једињењима [8]. Квантитација ППГ-ова у екстрактима огрлице била је заснована на УПЛЦ-УВ методи са детекцијом на 330 нм и екстерном стандардном калибрацијом коришћењемактеозид(Сигма-Алдрицх, 99 процената, ХПЛЦ) као

групни стандард. Линеарна калибрациона крива је припремљена у шест концентрација у опсегу од 1–200 уг/мЛ и показала је добру линеарност (Р2

0.999). Квантитативни резултати представљају средњу вредност СД за три ињекције и изражени су у милиграмимаактеозидеквивалента (екв.) по граму екстракта (мгактеозидекв/г).

2.5. Антирадикална активност ин витро

2.5.1. АБТС тест уклањања радикала

АБТС антирадикални тест је спроведен коришћењем методе коју су описали Контек ет ал. [9], са малим модификацијама како следи: 20% МеОХ је коришћено за припрему реагенса (7 мМ АБТС и 4,9 мМ калијума по-

сулфат); раствори екстракта ОЦ, ПА и ПР, у четири нивоа концентрације у опсегу од 100—400 уг/мЛ, и раствори Тролок, са шест нивоа концентрација у опсегу од 10 250 уг/мЛ, припремљени су са 50 посто МеОХ. Однос узорка према радном раствору АБТС био је 1:25 (в/в). Апсорбанца на 734 нм је измерена после 30 мин инкубације

у мраку помоћу УВ-вис спектрофотометра (Еволутион 260 Био,

Тхермо Фисхер Сциентифиц Инц., Валтхам, МА, САД).

Инхибиција апсорпције ( проценат ) је израчуната на следећи начин: [(Абсецон-

трол–Абссампле)/Абсцонтрол] ×100.

Израчунати су Тролок еквиваленти (ТЕ) екстраката метлиће репице

користећи формулу ТЕ=мсампле/мстандард, где је м нагиб праве

линијске криве (инхибиција апсорпције наспрам концентрације). ТЕ вредност од

узорак описује његову нормализовану активност против Тролок-а (ТЕстандард =

1.0). Вредности ИЦ50 за ОЦ, ПА и ПР екстракте и Тролок су биле

постигнути експериментално, затим су израчунати из њихове праве линије

криве (инхибиција апсорпције наспрам концентрације) и изражавају се у

уг/мЛ.

Тест је изведен у три примерка, а резултати су представљени

као средње вредности ± стандардне девијације (СД).

2.5.2. ДППХ тест уклањања радикала

ДППХ антирадикални тест је спроведен методом коју су описали Једрејек ет ал. [8] и Бранд-Виллиамс ет ал. [10], са малим модификацијама и то: раствори екстракта ОЦ, ПА и ПР, на четири нивоа концентрације у опсегу од 50▽ 250 уг/мЛ, и Тролок раствори, на шест нивоа концентрација у опсегу од 10▽ 250 уг/мЛ, припремљени су са 50% МеОХ. Однос узорка према ДППХ био је 1:19 (в/в). Апсорбанција на 517 нм је измерена након 30 мин инкубације у мраку коришћењем УВ-вис спектрофотометра (Еволутион 260 Био). Инхибиција апсорпције ( проценат ) је израчуната на следећи начин: [(Абсецонтролл–Абссампле)/Абсцонтрол] ×100. Вредности Тролок еквивалента (ТЕ) и ИЦ50 тестних узорака су израчунате на исти начин као у АБТС тесту (одељак 2.5.1). Тест је изведен у три примерка, а резултати су представљени као средња вредност ± СД.

2.6. Основни раствори тестираних биљних једињења и екстраката за експерименте са људском плазмом

Основни раствори тестираних једињења и биљних екстраката припремљени су у 50 процената ДМСО. Коначна концентрација ДМСО у испитиваним узорцима била је нижа од 0,05 одсто и њени ефекти су утврђени у свим експериментима.

2.7. Изолација људске плазме

Људска крв, односно плазма, добијена је од шест редовних давалаца (мушкараца и жена непушача) у банци крви (Лођ, Пољска) и медицинском центру (Лођ, Пољска). Крв је сакупљена као ЦПД раствор (цитрат/фосфат/декстроза; 9:1; в/в крв/ЦПД) или раствор ЦПДА (цитрат/фосфат/декстроза/аденин; 8,5:1; в/в; крв/ЦПДА). Донатори нису узимали никакве лекове или супстанце које изазивају зависност (укључујући дуван, алкохол и додатке антиоксидансима) најмање две недеље пре донације. Наша анализа узорака крви обављена је у складу са смерницама Хелсиншке декларације за људска истраживања и одобрена од стране Комитета за етику истраживања у експериментисању на људима на Универзитету у Лођу. Плазма је припремљена центрифугирањем свеже људске крви на 4500к г током 25 минута на собној температури. Концентрација протеина је израчуната мерењем апсорбанције испитиваних узорака на 280 нм, према процедури Вхитакер и Гранум [11].

2.8. Маркери оксидативног стреса у људској плазми

2.8.1. Мерење липидне пероксидације

Пероксидација липида у плазми је квантификована мерењем концентрације реактивних супстанци тиобарбитурне киселине (ТБАРС). Концентрација ТБАРС је израчуната коришћењем коефицијента моларне екстинкције (ε=156,000 М 1 цм 1 ). Метода је детаљније описана у другим деловима [12,13]. 2.8.2. Мерење карбонилних група Ниво карбонилних група је израчунат коришћењем коефицијента моларне екстинкције (ε=22,000 М 1 цм 1) и изражен је као нмол карбонил група/мг протеина плазме, према Бартошу [ 13] и Левине ет ал. [14]. 2.8.3. Одређивање тиолне групе Садржај тиолне групе у протеинима плазме мерен је спектрофотометријски коришћењем СПЕЦТРОстар Нано Мицроплате Реадер-а (БМГ ЛАБТЕЦХ, Немачка) апсорбанцијом на 412 нм са 5,5′-дитиол-бис-(2- нитробензојевом киселином). Метода је детаљније описана на другом месту [15–17].

2.9. Параметри хемостазе

2.9.1. Мерење протромбинског времена (ПТ)

ПТ је одређен коагулометријски коришћењем оптичке коагулације

Слова означавају резултате Тукијевог теста (п < 0.05), вредности са истим

слово унутар реда се не разликује битно.

2.9.2. Мерење тромбинског времена (ТТ)

ТТ је одређен коагулометријски коришћењем оптичког анализатора коагулације (модел К-3002, Кселмед, Грудзиадз, Пољска), према методи коју су описали Малиновска ет ал. [18].

2.9.3. Мерење активираног парцијалног тромбопластинског времена (АПТТ)

АПТТ је одређен коагулометријски коришћењем К-3002 оптичког анализатора коагулације (Кселмед, Грудзиадз, Пољска) према Мали нов ска ет ал. [18].

2.10. Анализа података К-Дикон тест је спроведен да би се елиминисали несигурни подаци.

Подаци су тестирани на нормалну дистрибуцију Шапиро-Вилковим тестом и једнакост варијансе Левеновим тестом. Статистички значајне разлике су идентификоване коришћењем АНОВА, праћене Тукеијевим тестом вишеструких поређења или Крускал-Валлисовим тестом. Поређења су сматрана значајним при п < 0.05.="" вредности="" су="" представљене="" као="" средње="" вредности="" ±="">