Тетрандрин ублажава повреде подоцита преко калцијум-зависне калпаин{1}} сигналне блокаде

Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Јин Динг, Сјуанли Танг, Јухуи Ванг, Донгронг Ју, Цаифенг Жу и Ђин Ју*

Апстрактан

Позадина:Подоцити су постали кључна мета за интервенције у протеинуријибубрегаболести. Многе студије су известиле да прекомерна експресија протеина 6 катионских канала пролазног рецепторског потенцијала (ТРПЦ6) у повреди подоцита повећава интрацелуларни Ца2 плус прилив и стимулише Ца2 плус-зависну сигнализацију протеазе калпаин-1. Традиционални кинески лек, тетрандрин, неселективни блокатор Ца2 плус канала, дуго се користи за лечење хроничнихбубрегаболест. Ово истраживање је имало за циљ да истражи могуће механизме који леже у основи анти-протеинурских својстава тетрандрина.

Методе:Истраживали смо учешће тетрандрина у Ца2 плус зависној сигнализацији од калпаина-1 у подоцитима миша и пацовима изазваним адриамицином нефропатијом. Циклоспорин А (ЦсА) и У73122 су коришћени као позитивне контроле. Испитивани су виталност ћелије, цитотоксичност, концентрација Ца2 плус, активност калпаина и нивои експресије мРНК и протеина сигналних путева калпаина-1. Мерене су клиничке и патолошке промене.

Резултати:Тетрандрин је смањио интрацелуларни Ца2 плус прилив у култивисане ТРПЦ6-подоците са прекомерном експресијом. У студијама ин витро и ин виво, примена тетрандрина је смањила активност калпаина и експресију калпаина-1 и обновила експресију низводног Талина-1 и нефрина. У поређењу са ЦсА, третман тетрандрином је показао супериорне инхибиторне ефекте на активност калпаина и експресију калпаина-1.

Закључци:Тетрандрин има терапеутски потенцијал у оштећењу подоцита тако што блокира Ца2 плус зависну активацију калпаин-1 сигналног пута. Тетрандрин је смањио протеинурију, побољшао функцију бубрега и ублажио патолошка оштећења бубрега.

Кључне речи:Тетрандрин, повреда подоцита, протеин 6 катјонског канала потенцијалног пролазног рецептора, калпаин-1

Цистанцхе тубулоса спречава болест бубрега, кликните овде да бисте добили узорак

Позадина

Подоцити су предуслов за одржавање селективне пермеабилности баријере гломеруларне филтрације и структурног интегритета гломерула. Повреда подоцита је обично повезана са протеинурским бубрежним обољењима, укључујући фокалну сегменталну гломерулосклерозу (ФСГС), мембранску нефропатију, болест минималних промена и дијабетичаре.бубрегаболест [1–4]. Заштита и рестаурација подоцита од штетних фактора представља велики изазов у ​​успешном лечењу болести бубрега.

Подоцити су високо специјализоване, терминално диференциране ћелије које се налазе изван базалне мембране гломерула и које карактеришу процеси стопала. Дисфункција регулације сигнализације калцијума у ​​подоцитима доводи до дезорганизације цитоскелета актина подоцита, оштећења процеса стопала, поремећаја дијафрагме са прорезом и протеинурије. Протеин 6 катионског канала са потенцијалним рецептором (ТРПЦ6), нови протеин повезан са прорезом дијафрагме у подоцитима, идентификован је као неспецифични Ца2 плус проводни јонски канал [5–8]. Експресија гломеруларног ТРПЦ6 је повећана код многих наследних и стечених протеинуријских болести. Претходне студије су известиле да прекомерна експресија ТРПЦ6 у подоцитима изазива супериорно повећање интрацелуларног Ца2 плус прилива, за који се верује да је одговоран за повреду ћелија подоцита. Повећано оптерећење калцијумом у подоцитима активира низводне сигналне путеве, укључујући калпаин-1, Талин-1, нефрин и калцинеурин, да модулира активност или експресију циљних гена [9–12]. Фангји Хуангки Танг је класична традиционална кинеска медицина (ТЦМ) за лечење нефротског синдрома [13]. Састоји се од шест биљака: Радик Степханиа Тетрандра (корен Степханиа тетрандра), Радик Астрагали (корен Астрагалус мембранацеус), Рхизома Атрацтилодис Мацроцепхалае (корен Атрацтилодес мацроцепхали), Радик Глициррхизабериасис оф Глициррхизабериасис (корен Атрацтилодес мацроцепхали), (корени Зингибер Оффицинале) и Фруцтус Зизипхи Јујубае (Фруцтус оф Зизипхус јујуба) [1]. Тетрандрин, једна од главних активних компоненти Радик Степханиа Тетрандра, неселективног блокатора Ца2 плус канала, тестиран је у клиничким испитивањима и за њега је индицирано да ублажи протеинурију и побољша функцију бубрега [14, 15]. Претходна студија је показала блокирајуће ефекте тетрандрина на Ца2 плус-зависну РхоА сигнализацију у подоцитима [16], али основни механизми нису разјашњени. Овде су развијени модели са прекомерном експресијом ТРПЦ6-ин витро и ин виво. Након примене тетрандрина, процењене су промене у ТРПЦ6-зависној Ца2 плус сигнализацији, укључујући низводне циљеве, калпаин-1, талин-1, нефрин и калцинеурин. Као позитивне контроле коришћени су циклоспорин А (ЦсА), инхибитор калцинеурина, који се широко користи у лечењу болести протеинурије) [17] и У73122, инхибитор отварања канала ТРПЦ6 [18].

Методе

Ћелијска култура и конструкција плазмида

Условно бесмртне ћелије ћелијске линије подоцита миша (МПЦ5), добијене од професора Петера Мундела (Медицинска школа Моунт Синаи, САД), одржаване су на 33 степена ради пролиферације, а затим померене на 37 степени ради диференцијације. Експресиони плазмид ТРПЦ6 је конструисан клонирањем пуне дужине кодирајуће ДНК секвенце гена ТРПЦ6 у ЕцоРИ/БамХИ места пЦДХ-ГФП-ПУРО вектора и упакована у лентивирус. Када су диференцирани и нарасли до приближно 80 процената конфлуенције, подоцити су засејани при густини ћелија од 4×104 по цм2 и инкубирани у комбинацији са ТРПЦ6-с прекомерном експресијом лентивируса. Стабилна ћелијска линија ТРПЦ6, верификована коришћењем ТРПЦ6 протеина и експресије мРНА, коришћена је за даље експерименте. Тус, МПЦ5 подоцити су подељени у три групе, нормалну контролну (НЦ) групу, групу бланко лентивируса (Лв-НЦ) и групу са прекомерном експресијом ТРПЦ6- (ОверТРП).

Ин витро ћелијски третман лековима и тест цитотоксичности

Вијабилности ћелија је приступљено коришћењем комплета за бројање ћелија{{0}} (ЦЦК-8) теста, у складу са упутствима произвођача. Укупно 5000 МПЦ5 подоцита по бунарчићу је узгајано у три примерка у 96-плочама са бунарима. Ћелије су третиране серијом ЦсА (0–2 μмол/Л; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД) и тетрандрином (0–40 μмол/Л; Сигма Алдрицх) на 37 степени током 48 сати. ЦЦК-8 је затим додат у плоче (10 μЛ/бажирић), које су затим инкубиране у мраку 2 сата. Апсорпција на 450 нм је мерена коришћењем читача микроплоча (БиоТек Инструментс, САД). Цитотоксичност је испитивана квантификацијом ослобађања лактат дехидрогеназе (ЛДХ) коришћењем комплета за испитивање цитотоксичности ЛДХ-ВСТ (Дојиндо Лабораториес, Јапан). Као позитивна контрола, ћелије су третиране са 10 μмол/ЛУ73122 (Цал биоцхем, САД) на 37 степени током 10 минута.

Екстракција РНК и квантитативна реверзна транскриптаза-полимераза ланчана реакција (кРТ-ПЦР)

Укупна РНК је припремљена из култивисаних ћелија ибубрегаткива коришћењем РНАисо Плус реагенса (Такара, Јапан) и реверзно транскрибовано у цДНА ПримеСцрипт™ РТ Мастер Мик кит (Такара) у складу са протоколом произвођача. кРТ-ПЦР је изведен коришћењем Повер СИБР Греен ПЦР Мастер Мик-а (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Немачка). Прајмерске секвенце циљних и референтних гена наведене су у додатној табели С1. Подаци су прикупљени коришћењем АБИ Присм 7900ХТ ФАСТ ПЦР система у реалном времену. Релативна квантификација експресије циљног гена је нормализована коришћењем компаративне 2-ΔΔЦт методе. Као интерна контрола коришћена је глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (ГАПДХ).

Вестерн блоттинг

укупни узорци протеина су екстраховани из култивисаних ћелија ибубрегамарамице. Концентрације протеина су одређене коришћењем комплета за анализу БЦА протеина (Тхермо Фисхер Сциентифиц). Узорци су раздвојени на 10% натријум додецил сулфат-полиакриламид гелу и пребачени на поливинилиден дифлуоридну мембрану. Мембрана је затим блокирана преко ноћи на 4 степена примарним антителима, наиме анти-ТРПЦ6 (Санта Круз, САД), анти-цал бол-1 (Абцам, УК), анти-Талин-1 (Абцам) , анти-нефрин (Санта Цруз) и анти-калцинеурин (Абцам). Након испирања, мембрана је инкубирана са козјим антизечјим ИгГ (Х плус Л; Јацксон ИммуноРесеарцх Лабораториес, САД). Мембрана је такође обрађена да детектује ГАПДХ (Абцам) за једнако оптерећење. Те траке које препознаје примарно антитело су визуелизоване, а оптичке густине трака протеина су анализиране коришћењем софтвера ТанонИмаге (Танон, Кина).

Одређивање цитосолног Ца2 плус у култивисаним подоцитима МПЦ5 подоцити су засејани и третирани тетрандрином, ЦсА и У73122 током 48х, 48х, односно 10мин. Подоцити су затим инкубирани са РПМИ-1640 допуњеним са 10 μМ Флуо-3АМ (Дојиндо Лабораториес) током 30 минута у мраку. Након тога, одмах су испрани физиолошким раствором пуферираним фосфатом, у којем су одржавани и узбуђени на 488 нм. Релативна концентрација цитосолног Ца2 плус јона процењена је мерењем интензитета флуоресценције коришћењем Зеисс ласерског конфокалног система за снимање (Зеисс, САД).

Мерење активности калпаина

Активност калпаина је одређена коришћењем комплета за анализу активности калпаина компаније Абцам Инц., према протоколу произвођача. Супернатант (150 уЛ) подоцита илибубрегаткива су узета у одговарајућем пуферском раствору (145 ммол/Л Нацл, 100 ммол/Л Трис-ХЦЛ, пХ7,3) и 0,15 мЛН-Суццинил-Леу-Тир-АМЦ (500 умол/Л). После 1- х инкубације на 37 степени у мраку, узорци су очитани помоћу флуорометра опремљеног ексцитационим филтером од 360 нм и емисионим филтером од 440 нм.

Модел пацова нефропатије изазване Адриамицином (АДРН) На основу Фермијеве апроксимације величине узорка [19] и разлике у протеинурији између контролне и моделне групе у нашим прелиминарним експериментима, одређен је укупан број пацова потребан у нашој студији. Укупно 56 здравих мужјака Спрагуе-Давлеи пацова, тежине приближно 200 г и старости око 8 недеља (Зхејианг Институте оф ТЦМ), насумично је подељено у седам група (н =8 пацова/група), односно АДР група, АДР плус група са ниским дозама тетрандрина (4мг/кг/д), АДР плус група са средњим дозама тетрандрина (8мг/кг/д), АДР плус група са високим дозама тетрандрина (16мг/кг/д), АДР плус група лечена ЦсА (30мг /кг/д), АДР плус средња доза тетрандрина (8мг/кг/д) у комбинацији са ЦсА (30мг/кг/д) групом и НЦ групом. Пацови у групи модела и групама за лечење лековима су анестезирани интраперитонеалном ињекцијом кетамин хидрохлорида (50 мг/кг), а две дозе АДР (4 мг/кг) су убризгане у каудалну вену да би се развио ФСГС модел пацова. Након 12 недеља, узорци урина пацова су сакупљани током 24 сата коришћењем метаболичких кавеза, након чега је уследило прикупљање крви и жетвабубрези. Уочена је клиничка ефикасност, а измене 24-х протеина у урину, албумина у плазми, креатинина у серуму (Сцр) и азота у урину у крви (БУН) су мерене коришћењем комерцијално доступних дијагностичких комплета са аутоматским хемијским анализатором (ХИТАЦХИ 7180). ).

Све експерименталне процедуре које укључују употребу животиња одобрене су од стране Етичког комитета за експерименте на животињама на Зхејианг институту ТЦМ (Тианмусхан Роад Но.132) и стриктно су спроведене у складу са принципима наведеним у НИХ Водичу за негу и употребу лабораторијских животиња .

Хистолошко бојење, електронска микроскопија и анализа

Ратбубрезису фиксирани у параформалдехиду, дехидрирани коришћењем степеноване серије етанола и уграђени у парафин. Секције (5- μм-дебљине) су обојене хематоксилином и еозином (Х&Е) и Массоновим трихромом и прегледане под оптичким микроскопом. Бубрези су перфузирани и фиксирани глутаралдехидом, а затим исечени на 1-мм3 блокове ткива за уградњу епоксида. Електронска микроскопија је урађена стандардним процедурама. Пет ултрамикрографија је насумично добијено из сваког узорка. Стопа фузије процеса стопала подоцита (ПФР) је израчуната коришћењем следеће формуле: ПФР ( проценат )=∑ЛФП / ∑ЛБМ×100 процената, где је ∑ЛФП укупна дужина спојеног процеса стопала, а ∑ЛБМ је укупна дужина периферне капиларне базалне мембране (БМ).

Статистичка анализа

Подаци су изражени као средња вредност±стандардна грешка мерења и анализирани коришћењем СПСС 20.0 (ИБМ Статистицс СПСС, САД) и ГрапхПад Присм 6 за Виндовс (ГрапхПад Софтваре Инц., САД). Нормална дистрибуција је процењена помоћу кк дијаграма и СВ теста. Подаци су показали нормалну дистрибуцију. Када су упоређене две групе података, примењен је т-тест независних узорака. Разлике између три или више независних група су упоређене коришћењем једносмерне анализе варијансе праћене Тукијевим пост хоц тестом. Статистички значај је постављен на стр<>

Резултати

Избор оптималних концентрација и цитотоксичности тетрандрина, ЦсА и У73122

ЦЦК{{0}} тест је коришћен за откривање виталности ћелија. Као што је приказано на сликама 1а и б, максимална концентрација од 10μмол/Л тетрандрина и 0.1μмол/Л ЦсА није утицала на одрживост МПЦ5 подоцита. Тест ослобађања ЛДХ је даље потврдио да 10 μмол/Л тетрандрина и 0,1 μмол/Л ЦсА током 48 сати нису показали токсичност, док је 10 μмол/ЛУ73122 током 10 минута показало очекивану токсичност (слика 1ц). Због тога су наредни експерименти са ћелијама користили тетрандрин и ЦсА при 10 μмол/Л и 0,1 μмол/Л, респективно.

Тетрандрин је смањио интрацелуларни Ца2 плус инфукс у култивисане ћелије МПЦ5 које прекомерно експримирају ТРПЦ6

Користећи плазмидну трансфекцију, успешно је успостављен ћелијски модел прекомерне експресије ТРПЦ6 у МПЦ5 подоцитима. кРТ-ПЦР и Вестерн блот анализа су показали да су нивои експресије ТРПЦ6 у Овер-ТРП групи значајно порасли у поређењу са онима у НЦ и Лв-НЦ групама (п<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

Флуоресцентно снимање (слика 2ц) и полуквантитативна анализа (слика 2д) су показале да прекомерна експресија ТРПЦ6 појачава интрацелуларни Ца2 плус прилив, док није било очигледних разлика између НЦ и Лв-НЦ група. Десет ћелија ОверТРП групе је затим третирано експерименталним лековима. Групе за претходну терапију (тетрандрин, ЦсА и У73122) имале су инхибиторне ефекте на интрацелуларни Ца2 плус прилив (П<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Ефекти тетрандрина на активност и експресију калпаина-1, калцинеурина, Талин-1 и нефрина у МПЦ5 ћелијама

Показало се да интрацелуларни Ца2 плус активира калпаин, Ца2 плус зависну цистеин протеазу и калцинеурин, Ца2 плус /калмодулин зависну протеин фосфатазу. У складу са претходним запажањима, нивои активности и експресије калпаина и калцинеурина у групи са прекомерним ТРП били су већи од оних у НЦ и Лв-НЦ групама (п<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0.05) и нефрин (стр<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0.05; Слика 3ф, г, ј и к).

Гелови и мрље пуне дужине укључени су у додатну слику С1.

Експерименти ин виво користећи модел АДРН пацова Да би се окарактерисао одговор на инхибицију сигнализације ТРПЦ6/калпаин-1 посредоване тетрандрином ин виво, развијен је модел АДРН код пацова. Профили експресије мРНА и протеина ТРПЦ6 су значајно повећани у АДРН групи у поређењу са онима код пацова храњених нормалном храном (НЦ група; п<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

Третман са ЦсА није блокирао активацију калпаина изазвану прекомерном експресијом ТРПЦ6 (слика 4ц), а ефекат није био тако снажан као ефекат тетрандрина на експресију протеина бола у калпаину (п<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

Третман са ЦсА није блокирао активацију калпаина изазвану прекомерном експресијом ТРПЦ6 (слика 4ц), а ефекат није био тако снажан као тетрандрина на експресију протеина калпаина-1 (п<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

Даље, процењена је експресија Талина-1 и нефрина (сл. 4х, и, л и м). Нивои и талина-1 и нефрина су смањени код АДРН пацова у поређењу са оним у НЦ групи (п<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

Гелови и мрље пуне дужине укључени су у додатну слику С2.

Тетрандрин је потиснуо прогресију АДРН-а и спасио хистопатологију. Ефекат тетрандрина набубрегафункција код Спрагуе-Давлеи пацова третираних АДРН је накнадно процењена (Слика 5а-д). Није било почетних значајних разлика у нивоима протеинурије 24-х, Сцр и БУН међу групама. Дванаест недеља касније, нивои 24х-протеинурије, Сцр и БУН у АДРН групи су статистички повећани, док је ниво албумина у плазми био значајно смањен, у поређењу са онима у НЦ групи (П<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0.05; подаци нису приказани).

Промене у хистоморфологији су приказане на слици 6. Код АДРН пацова, Х&Е и Массон бојење је показало ФСГС, тубулоинтерстицијалну фиброзу и инфилтрацију бубрежних интерстицијских ћелија. Поред тога, електронско микроскопско снимање гломерула открило је веома избрисане, угојене и спојене процесе стопала подоцита са 80–100 процената ПФР подоцита. Пацови у подгрупама тетрандрина (групе са средњим и високим дозама) су имали мање лезија од групе АДР са различитим степеном, а побољшање у групи са високим дозама је надмашило оно у групи са средњом дозом. У групама са ниским, средњим и високим дозама третираних тетрандрином, ПФР подоцита је био 70-80 процената, 50-60 процената и 30-40 процената, респективно. Ови подаци сугеришу да је тетрандрин штитио од структурних оштећења бубрежних гломерула изазваних применом АДР-а. Није било значајних разлика у патолошким променама под светлосним микроскопом међу групама (високе дозе тетрандрина, ЦсА и тетрандрина у комбинацији са ЦсА). Поред тога, ПФР подоцита у АДРН групи која је третирана ЦсА била је иста као она у групама које су третиране високим дозама тетрандрином.

Дискусија

Подоцити су постали све важнији као мета за интервенције у ФСГС и сродним нефротским болестима [20, 21]. Овде, на основу ин витро и ин виво података, јесте

показао да је заштита подоцита и антипротеинурички ефекат тетрандрина, неселективног блокатора Ца2 плус канала, посредован инхибицијом интрацелуларног Ца2 плус прилива и Ца2 плус-зависне калпаин-1 сигналне каскаде, укључујући Талин-1 , нефрин и калцинеурин. Тетрандрин је био ефикаснији него у ометању инхибиције калпаина{7}}.

Према претходним налазима, подоцитни ТРПЦ6 је канал који углавном доприноси променама Ца2 плус прилива у нормалним и патолошким условима [7, 22]. Опште је познато да активност калпаина зависи од нивоа калцијума и да је повезана сабубрегаповреда, посебно повреда реналног анти-гломеруларног БМ [10, 23]. Међу 15 идентификованих изоформи калпаина, недавно је показано да калпаин-1 повезује активност ТРПЦ6 са повредом подоцита [24]. Извештава се да калпаин-1 цепа причврсни протеин Талин-1 повезан са цитоскелетом подоцита и протеин дијафрагме прореза, нефрин, који ремети интегритет подоцита и изазива озбиљну протеинурију [8–12, 16]. Калцинеурин је фосфатаза зависна од Ца2 плус за коју је раније показано да игра улогу у подоцитима ибубрегафункција. Нагомилани докази све више указују на то да калпаин може да цепи и активира калцинеурин на протеолитички начин [25, 26]. Ова студија је створила моделе прекомерне експресије ТРПЦ6 вирусном инфекцијом у култивисаним подоцитима и ињекцијом адриамицина код СД пацова. У складу са тим, показали смо да ТРПЦ6-посредује Ца2 плус прилив активира активност калпаина и експресију калпаина-1 члана породице калпаина. Повећани калпаин-1 је потом цепао низводни Талин-1 и нефрин.

Тетрандрин је алкалоид екстрахован из биљке традиционалне кинеске медицине и неселективни је блокатор Ца2 плус канала. Овде је поново потврђено да тетрандрин инхибира прекомерну експресију ТРПЦ6 и смањује прилив Ца2 плус у ћелије и пацове који прекомерно експримирају ТРПЦ6, као што је претходно документовано [16]. Што је још важније, ова студија се фокусира на интервентни ефекат тетрандрина на низводни сигнални пут зависан од калцијума. Уочено је да, за разлику од ЦсА, тетрандрин смањује активност неутралне протеазе (калпаин) активиране калцијумом. Штавише, тетрандрин је смањио експресију породице протеаза активираних калцијумом, калпаина-1, и вратио смањену експресију Талина-1 и нефрина. У поређењу са ЦсА, примена тетрандрина је показала супериорне ефекте на инактивацију калпаина и смањену експресију калпаина-1. Ови резултати су показали да тетрандрин има терапеутски потенцијал у оштећењу подоцита тако што блокира ТРПЦ6-зависну активацију калпаин{13}} сигналног пута.

Фосфолипаза Ц (ПЛЦ) је идентификована као ТРПЦ{0}}везујући партнер [27]. У73122 инхибира ПЛЦ тако да се ствара мање диацилглицерола и смањује се отварање канала ТРПЦ6 [18, 24]. У73122 је, стога, коришћен паралелно као позитивна контрола, и показао је приметан ефекат у смањењу интрацелуларног Ца2 плус прилива, инхибицији активности калпаина и експресије калпаина-1 у подоцитима који прекомерно експримирају ТРПЦ6. Међутим, ин витро тестови цитотоксичности су показали очигледну токсичност подоцита.

У овој студији, након 12 недеља ињекције АДР-а, озбиљна протеинурија, хипоалбуминемија и повишени нивои БУН и Сцр били су евидентни код пацова који су третирани АДР{1}}. Светлосна микроскопија је открила ФСГС, тубулоинтерстицијалну фиброзу и инфилтрацију интерстицијалних инфламаторних ћелија бубрега код АДРН пацова. Електронска микроскопија је показала широко распрострањено брисање процеса стопала. Подаци ин виво су даље показали да терапија тетрандрином може смањити протеинурију, побољшати функцију бубрега и ублажити прогресију гломерулосклерозе. После третмана тетрандрином, патолошке промене под светлосним микроскопом и електронским микроскопом, 24-х протеинурија, албумин плазме, Сцр и БУН код АДРН пацова су значајно побољшане у поређењу са онима у НЦ групи.

Инхибитор калцинеурина, ЦсА, дуго се користи за лечење протеинуријебубрегаболести [28]. Калцинеурин је клинички важан као директна мета имуносупресивног лека ЦсА [17, 29]. ЦСА смањује експресију калцинеурина и смањује нуклеарни фактор активираних Т-ћелија посредован калцинеурином [30–32]. Недавни докази подржавају стабилизујући ефекат ЦсА на цитоскелет актина подоцита, као што је синаптоподин, блокирањем дефосфорилације синаптоподина посредоване калцинеурином [17]. Такође је показано да калпаин може да цепи и активира калцинеурин на протеолитички начин [25, 26]. Подаци из ове студије су поново потврдили да ЦсА инхибира активност и експресију калцинеурина јаче од тетрандрина. Као што је раније објављено, изгледа да ЦсА не утиче директно на активност калпаина.

Главно ограничење студије био је неуспех да се демонстрира ефекат зависан од дозе међу подгрупама тетрандрина (групе са ниском дозом, средњом дозом и високом дозом). Једно од могућих објашњења могло би бити да је опсег дозе који смо користили био превисок за пацове. Поред тога, индивидуалне разлике у експерименту на животињама могу бити знатно веће од разлика у дозама. Релативно мала величина узорка може смањити статистичку моћ. Стога су потребне даље студије које укључују знатно мање дозе и одговарајућу величину узорка да би се утврдио тачан опсег дозе и ефекат тетрандрина код АРДН пацова.

Укратко, у регулацији сигналних путева калцијума, тетрандрин је показао очигледан инхибиторни ефекат на калпаин-1, док је ЦсА директно утицао на инхибицију калцинеурина. Ови налази сугеришу да комбиновано лечење тетрандрином и ЦсА може утицати на вишеструке циљеве мреже за сигнализацију калцијума како би се побољшали клинички исходи. Потврђујуће студије су неопходне да би се потврдила ова запажања, као и да би се разјаснили механизми синергијских ефеката.

Скраћенице

ФСГС: Фокална сегментна гломеруларна склероза; МЦД: болест минималних промена; МН: Мембранозна нефропатија; ДКД: Дијабетичарбубрегаболест; ТРПЦ6: Протеин 6 катјонског канала потенцијалног рецептора; Ца2 плус : Калцијум; ТЦМ: Класична традиционална кинеска медицина; Тет: Тетрандрин; ЦсА: циклоспорин А; Сцр: Креатинин у серуму; БУН: Азот у урину у крви; ПФР: Брзина фузије процеса; БМ: Базална мембрана; АДРН: Адриамицин-индукована нефропатија; ПЛЦ: Фосфолипаза Ц.

Референцес

1. Гарг П. Преглед биологије подоцита. Ам Ј Непхрол. 2018;47(Суппл 1):3–13.

2. Кхалилпоурфарсхбаф М, Хајиагхаалипур Ф, Селварајан КК, ет ал. Терапије засноване на мезенхималним матичним ћелијама против оштећења подоцита код дијабетичке нефропатије. Тиссуе Енг Реген Мед. 2017;14:201–10.

3. Нагата М. Повреда подоцита и њене последице. Киднеи Инт. 2016;89:1221–30.

4. Павенстадт Х, Криз В, Кретзлер М. Целл биологи оф тхе гломерулар подоците. Пхисиол Рев. 2003;83:253–307.

5. Риехле М, Бусцхер АК, Гохлке БО, ет ал. ТРПЦ6 Г757Д мутација губитка функције повезана је са ФСГС. Ј Ам Соц Непхрол. 2016;27:2771–83.

6. Илатовскаиа ДВ, Бласс Г, Палигин О, ет ал. НОКС4/ТРПЦ6 пут у регулацији калцијума у ​​подоцитима и оштећењу бубрега код дијабетесне болести бубрега. Ј Ам Соц Непхрол. 2018;29:1917–27.

7. Реисер Ј, Полу КР, Моллер ЦЦ, ет ал. ТРПЦ6 је канал повезан са гломеруларним прорезом дијафрагме неопходан за нормалну функцију бубрега. Нат Генет. 2005;37:739–44.

8. Хуанг Х, Иоу И, Лин Кс, ет ал. Инхибиција сигналног пута ТРПЦ6 ублажава повреду подоцита изазвану ТГФ- 1. Целл Пхисиол Биоцхем. 2017;41:163–72.

9. Верхеијден КАТ, Сонневелд Р, Баккер-ван Беббер М, ет ал. Протеаза зависна од калцијума Цалпаин-1 повезује активност ТРПЦ6 са повредом подоцита. Ј Ам Соц Непхрол. 2018;29:2099–109.

10. Пелтиер Ј, Беллоцк А, Перез Ј, ет ал. Активација и секреција калпаина промовишу повреду гломерула код експерименталног гломерулонефритиса: докази од калпастатин-трансгених мишева. Ј Ам Соц Непхрол. 2006;17:3415–23.

11. Тиан Кс, Ким ЈЈ, Монклеи СМ, ​​ет ал. Талин1 повезан са подоцитима је критичан за одржавање баријере гломеруларне филтрације. Ј Цлин Инвестиг. 2014;124:1098–113.

12. Јианг Л, Динг Ј, Тсаи Х, ет ал. Прекомерна експресија пролазног потенцијалног рецепторског катјонског канала 6 у подоцитима индукује преуређење цитоскелета кроз повећање интрацелуларног Ца2 плус и РхоА активације. Екп Биол Мед (Маивоод). 2011;236:184–93.

13. Лиу Кс, Зхоу КГ, Зху КСЦ, ет ал. Скрининг потенцијалних активних компоненти Фангји Хуангки танга у лечењу нефротског синдрома коришћењем интегрисане метаболомике засноване на „корелацији између хемијских и метаболичких профила“. Фронт Пхармацол. 2019;10:1261.

14. Лиу КЦ, Лин ИЈ, Хсиао ИТ, ет ал. Тетрандрин индукује апоптозу у ћелијама хуманог назофарингеалног карцинома НПЦ-ТВ 039 стресом ендоплазматског ретикулума и Ца2 плус/Цалпаин путевима. Антицанцер Рес. 2017;37:6107–18.

15. Ванг ИЈ, Хе ЛК, Сун В, ет ал. Оптимизовани пројекат традиционалне кинеске медицине у лечењу хроничне болести бубрега стадијум 3: мултицентрично двоструко заслепљено рандомизовано контролисано испитивање. Ј Етхнопхармацол. 2012;139:757–64.

16. Иу Ј, Зху Ц, Иин Ј, ет ал. Тетрандрин потискује пролазни потенцијал рецептора за оштећење подоцита изазвано прекомерном експресијом протеина катјонског канала 6 преко блокаде РхоА/РОЦК1 сигнализације. Друг Дес Девел Тхер. 2020;14:361–70.