Укупни гликозиди Цистанцхе Десертицола промовишу опоравак неуролошке функције индукујући неуроваскуларну регенерацију путем Нрф- 2/Кеап-1 пута у МЦАО/Р пацовима-Ⅰ

УВОД

Мождани удари се сматрају главним узроком смрти и инвалидитета у свету. Скоро 87% свих случајева можданог удара је изазвано исхемијским можданим ударом. Тренутно, најефикаснији агенс и једини лек који је одобрила ФДАлечење исхемијског можданог удараје рекомбинантни ткивни активатор плазминогена. Међутим, велики број пацијената са можданим ударом не реагује на овај лек, због његовог уског терапијског временског оквира и озбиљног ризика од хеморагијских компликација. Главни изазов тромболитичког лечења је повреда исхемије/реперфузије (И/Р), која се сматра главним узроком повреде мозга и деструкције функције. Реперфузија након церебралне исхемије повећава ризик од крварења у мозгу док доводи до неуроваскуларних повреда и производње прекомерних реактивних врста кисеоника (РОС) које оштећују крвно-мождану баријеру. Неколико студија је потврдило да је поремећај БББ главни узрок патогенезе исхемијског можданог удара.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ЛЕЧЕЊЕ ИСХЕМИЈСКОГ МОЖДА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

БББ се углавном састоји од ендотелних ћелија, перицита, астроцита, неурона и базалних мембрана. Основне компоненте БББ-а су церебралне микроваскуларне ендотелне ћелије које су спојене чврстим спојевима, ограничавајући тако егзогене молекуле у мозак. Патолошке промене тесних спојева – посебно оклудина, клаудина-5 и зонула оклудентса-1 (ЗО-1) – значајно утичу на функцију БББ током исхемијског можданог удара, посебно на пропустљивост баријере. Током И/Р периода, прекомерни РОС је један од главних фактора који доводе до директног оштећења неурона мозга. Прекомерна производња РОС-а доводи до деградације одређених спојева и поремећаја БББ-а, што доводи до тога да егзогени молекули улазе у мозак кроз БББ, што доводи до погоршања оштећења мозга. Стога се заштита БББ антиоксидансима сматра потенцијалним начином за спречавање реперфузионих повреда.

Поред слома БББ, И/Р може довести до неуроваскуларне повреде и неуронске смрти. Током можданог удара, повећана смрт неуронских ћелија може бити резултат оксидативног стреса, а бројне студије су показале да РОС погоршава тежину можданог удара и неуролошка оштећења. Иако клиничка испитивања нису дала задовољавајуће резултате, неуропротекција је и даље обећавајућа стратегија за лечење акутног исхемијског можданог удара. Стога је проналажење ефикасних неуропротективних лекова за лечење можданог удара корист за пацијенте са можданим ударом.

Традиционална кинеска медицина (ТЦМ) предузима мере да интервенише против унутрашње неравнотеже тела. Због сложене патогенезе исхемијског можданог удара, мултифакторски ефекат ТЦМ и његових активних састојака игра кључну улогу у лечењу можданог удара.Цистанцхедесертицола ИЦ Ма, распрострањена у сушним или полусушним областима широм Монголије и северозападне Кине, била је широко коришћена ТЦМ биљка за лечење различитих болести као што су заборавност и депресија више од 1,000 године у Кини. Савремена фармаколошка истраживања су показала да су сирови екстракти из Ц. десертицола показали вишеструке фармаколошке активности, као нпр.побољшање функције учења и памћења, неуропротекције, имунитета, антиоксиданса, ефеката против старења и умора. Хемијска анализа Ц. десертицола је показала да њени главни састојци укључујуфенилетаноидни гликозиди, иридоидни гликозиди, полисахариди и олигосахариди. Међутим, активне компоненте Ц. десертицола за заштиту мозга нису сасвим јасне.

Неуропротективна својства Ц. десертицола имплицирају њен терапеутски потенцијал код когнитивних болести као што су мождани удар и депресија, као и Алцхајмерова болест. Међутим, истраживања о утицају Ц. десертицола на мождани удар, укључујући његове активне компоненте и механизме деловања, веома су ограничена. У овом раду истражили смо заштитни ефекат три екстракта из Ц. десертицола, укупних гликозида (ТГ, фенилетаноидних гликозида и других гликозида), полисахарида (ПС) и олигосахарида (ОС) на церебралне И/Р повреде. Наши налази могу допринети тачној клиничкој примени Ц. десертицола и обезбедити средство кандидата затерапија исхемијског можданог удара.

МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ

Хемикалије и реагенси

Стабљике Цистанцхе десертицола су купљене из Алашана, Унутрашња Монголија, и идентификоване од стране једног од аутора (П.-Ф. Ту). ТГ, ПС и ОС припремљени су према нашој претходно објављеној методи. Квантитативна анализа ТГ је извршена течном хроматографијом високих перформанси (ХПЛЦ) као што је претходно описано, а њен хроматограм је приказан на слици 1. Главне компоненте ТГ су ехинакозид, тубулозид А, актеозид, изоактеозид и 2'-ацетилактеозид; њихов садржај је 163,05 мг/г, 4,125 мг/г, 41,66 мг/г, 22,655 мг/г, односно 12,045 мг/г. Садржај ПС и ОС је 69,42% и 65,24%, респективно, како је утврђено ХПЛЦ и анализом фенол-сумпорна киселина, респективно.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ЛЕЧЕЊЕ ИСХЕМИЈСКОГ МОЖДА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Стандардне референце ехинакозида (А0282), тубулозида А (А0942), актеозида (А0280), изоактеозида (А0281) и 2'-ацетилактеозида (А0943) купљене су од Цхенгду Муст Биотецхнологи. Чистоћа свих стандарда је више од 98%. Ниссл Стаин Х&Е комплети су купљени од Бостера. Едаравоне (Т0407-1) ​​је купљен од Таргет Мола (Шангај, Кина). Купљени су зечји антипацовски МАП-2 (аб32454), Нрф-2 (аб31163), ПДГФРб (аб32570), Кеап-1 (аб66620) и миш ЦД31 против пацова (аб24590) од Абцам Инц. Раббит против пацова Цлаудин5 (БС1069), ЗО-1 (БС9802М) и Оццлудин (БС72035) су купљени од Биоворлд Тецхнологи. Целл Сигналинг Тецхнологи Инц. (Бостон, МА, САД) је био извор зечјег синапсина-1 против пацова (СИН,5297Т), ПСД95 (3450Т), а-Смоотх Мусцле Ацтин (а-СМА,19245Т). ГАПДХ (ХРП-60004) је купљен од Протеинтецх Гроуп, Инц. Секундарна антитела је испоручила Зхонгсхан Голден Бридге Биотецхнологи (Пекинг, Кина). Хоецхст 33258 је добијен од Беиотиме.

Животиње

Спрагуе-Давлеи пацови (мужјаци, тежине 250–300 г) су добијени од Витал Ривер Лаборатори Анимал Тецхнологи и смештени у климатизованој просторији која је држана у циклусу светлости/мрака од 12 сати. Сви експерименти на животињама изведени су у складу са смерницама АРРИВЕ за истраживање на животињама, а одобрени су од стране Институционалног комитета за негу и употребу животиња Пекиншког универзитета.

Експериментални протоколи на животињама

Пацови су подвргнути МЦАО/Р, као што је претходно описано (Ванг ет ал., 2018). Укратко, откривене су лева заједничка каротидна артерија (ЦЦА), спољашња каротидна артерија (ЕЦА) и унутрашња каротидна артерија (ИЦА), а 3-0 најлонски монофиламентни шав је уметнут из ЕЦА у ИЦА све док није стигао до средине церебрална артерија (МЦА). После 1,5 х МЦА оклузије, реперфузија је симулирана уклањањем филамента. Током хируршке процедуре, телесна температура свих пацова је одржавана на 37,0 степени. Дрог

Администрација

Пацови су насумично подељени у шест група коришћењем СПСС софтвера верзије 22.0 како је описано: нормална група (НОР); група модела (МОД); група едаравона (позитиван лек, 6 мЛ/кг, ЕДИ); ТГс група (280 мг/кг, ТГс); Група ПС (280 мг/кг, ПС) и група ОС (280 мг/кг, ОС). ТГ, ПС и ОС су давани једном дневно након МЦАО/Р током 14 дана. Групе НОР и МОД су третиране нормалним физиолошким раствором. Број животиња приказан је у табели 1.

Мерење тежине и модификованих резултата неуролошког дефицита (мНСС)

Телесна тежина је праћена 14. дана коришћењем АДВЕНТУРЕ™ дигиталне ваге (ОХАУС, Њу Џерси, САД). мНСС је процењен према методи коју је описао ФЈ Ванг (Ванг ет ал., 2018), са мањим ревизијама.

2, 3, 5-Бојење трифенилтетразолијум хлоридом (ТТЦ)

Волумен инфаркта је измерен као што је претходно описано. Укратко, мозгови су подељени на седам једнако распоређених короналних блокова (2 мм). Ови делови су обојени са 2% ТТЦ на 37 степени током 15 минута. Волумен инфаркта (%)=(запремина ипсилатералне исхемијске хемисфере − запремина контралатералне исхемијске хемисфере)/запремина контралатералне исхемијске хемисфере × 100.

Ниссл и Х&Е бојење

Пацови су дубоко анестезирани, а цео мозак је затим брзо уклоњен из лобање фиксиран коришћењем 4% параформалдехида уграђеног у парафински восак и исечен на кришке дебљине 7 µм. Секције су обојене Нисслом и Х&Е. У овој студији, шест насумичних поља 200 × 200 µм је ухваћено у сваком узорку ткива светлосним микроскопом. Број Нисслових тела је пребројан помоћу ИПП софтвера верзије 6.0.

Еванс Блуе Тест

Пацовима је убризган 2% ЕБ након МЦАО/Р. Два сата касније, пацови су анестезирани и цео мозак је затим брзо уклоњен и хомогенизован у ацетону. Супернатанти су анализирани на 620 нм помоћу читача апсорбанције 800 ТС.

Мерење активности каталазе (ЦАТ), супероксид дисмутазе (СОД), малондиалдехида (МДА) и глутатион пероксидазе (ГСХ-Пк)

Сви узорци серума су центрифугирани на 4,000 × рпм током 15 минута на 4 степена, а затим анализирани да би се откриле активности МДА, ЦАТ, СОД и ГСХ-Пк према упутствима произвођача.

Вестерн блоттинг анализа

Ткива мозга (100 мг) сакупљена од сваког пацова су хомогенизована и лизирана у РИПА пуферу за лизу, а затим анализирана да би се детектовала концентрација протеина коришћењем БЦА комплета. Укупни протеини ткива су стављени на 10% СДС-ПАГЕ гелове и пребачени на нитроцелулозну мембрану. Мембрана је блокирана коришћењем 5% обраног млека, а затим инкубирана преко ноћи са примарним антителима на 4 степена. Мембрана је затим инкубирана са секундарним антителом. Вестерн блот анализа је анализирана коришћењем Кодак Дигитал Имагинг Систем.

Имунофлуоресцентна анализа

Урађено је имунофлуоресцентно бојење за ЦД31, а-СМА, ЗО-1, цлаудин5, оклудин, ПДГФРб, СИН, ПСД95, МАП-2, Нрф-2 и Кеап-1. Примарна антитела против Нрф-2, ЦД31, а-СМА, ЗО-1, цлаудин5, оклудина, ПДГФРб, СИН, ПСД95, МАП-2 и Кеап-1 су разређена до 1 :200 и 1:100, респективно. Секундарна антитела Алека Флур 488 мишјег анти-зечјег ИгГ и родаминског (ТРИТЦ) козјег анти-зечјег ИгГ-а су разблажена до 1:200. Језгра су обојена Хоецхст 33258. Слике су снимљене коришћењем Вецтра® Поларис™ аутоматизованог система квантитативне патологије (ПеркинЕлмер, САД). Експресија протеина је анализирана коришћењем ИПП софтвера верзије 6.0. Статистичка анализа

Сви подаци су описани као средња вредност ± СД. СПСС софтвер верзија 22.0 је урађен за статистичку анализу. Једносмерна АНОВА је коришћена приликом поређења различитих група. П < 0.05 се сматрало статистичком разликом.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА АНТИИСХЕМИЈСКУ БОЛЕСТИ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

РЕЗУЛТАТИ

ТГ повећавају телесну тежину и смањују оштећења мозга код МЦАО/Р пацова

После 14 дана лечења са ТГ, ПС, Осс и ЕДИ, процењене су телесне тежине, неуролошки дефицити и запремине инфаркта И/Р пацова. Резултати су показали да је телесна тежина у МОД групи значајно смањена, док је смањена тежина у групама ТГ, ПС и ЕДИ повећана (Слика 2А). Резултати неуролошког дефицита су значајно смањени ЕДИ и ТГ (Слика 2Б). Резови мозга код пацова групе НОР су били тамно црвени и није било инфаркта, док су пацови групе МОД показали велики ипсилатерални церебрални инфаркт. Након третмана ТГ, запремине инфаркта су значајно смањене (Слике 2Ц, Д). Третман ПС и ОС није показао очигледан ефекат на горе наведене индексе. Горе наведени подаци су показали да ТГ могу значајно да ублаже церебралну повреду изазвану И/Р, али ПС и ОС не могу.

ТГ побољшавају хистопатолошка оштећења код МЦАО/Р пацова

Да би се утврдили неки од ефеката третмана ТГ, ПС и ОС на хистопатолошка оштећења, Х&Е бојење је урађено да би се открила патолошка оштећења. Хистоморфолошке структуре мозга у НОР групи су редовно распоређене. Морфолошке промене у ТГ групама биле су мање од оних у МОД групи. Међутим, групе за лечење ПС и ОС нису показале значајно побољшање морфолошких промена (Слика 3).

ТГс ублажавају повреде неурона након И/Р-индукованих пацова

Ниссл бојење је показало хистопатолошке промене неурона у пенумбри исхемијског подручја. Као што је приказано на слици 4, нормални неурони су имали јасну нуклеолу и нетакнуту структуру. У групи са МОД, неурони су имали увећане међућелијске просторе. Ниссл тела су нестала, смежурана и дубоко умрљана. Међутим, ове промене су ретко примећене у групама ЕДИ, ТГ и ПС. Ови резултати су показали да би ТГ и ПС могли значајноублажити оштећење неурона изазвано исхемијом/реперфузијом.

ТГ ублажавају поремећај БББ после пацова третираних И/Р

Евансов плави тест је класична метода за истраживање промене пермеабилности БББ. Резултати експеримента су показали да је повећана Еванс плава уочена у МОД групи, док је значајно смањена Еванс плава код пацова третираних ТГ и ЕДИ. Штавише, није било значајне разлике између група на терапији ПС и ОС (Слика 5). Ови резултати сугеришу да би ТГ могли значајно умањити поремећај БББ.

ТГ подстичу ангиогенезу код И/Р повређених пацова

Новије студије показују да ангиогенеза игра кључну улогу у неуролошком функционалном опоравку и прогностичким исходима након акутног исхемијског можданог удара (Иуен ет ал., 2015). Да би се проценили ефекти ТГ, ПС и ОС на ангиогенезу, ЦД31 и а-СМА су коришћени за квантификацију капиларних бројева. Имунофлуоресцентно бојење је показало да је МОД група изазвала значајно смањење експресије ЦД31 (Слике 6А, Б) и а-СМА (Слике 6Ц, Д) у пенумбри исхемијских подручја И/Р пацова, у поређењу са нормалним пацовима . Овај резултат је илустровао да И/Р може изазвати васкуларно оштећење у полусјени кортекса исхемијских хемисфера. Међутим, третман ТГ и ЕДИ значајно је повећао густину капилара, ангиогенезу и артериогенезу на шта указује повећана експресија ЦД31 и а-СМА. Ови резултати сугеришу да би ТГ могли да промовишу ангиогенезу у исхемијској пенумбри И/Р пацова, али ПС и ОС нису могли.

ТГ повећавају експресију протеина тесног споја код И/Р повређених пацова

Поремећај БББ може повећати садржај воде у мозгу и отицање ткива, што доводи до повреде мозга. Протеини чврстог споја су важне структурне компоненте БББ. Да би се тестирало да ли третман ТГ, ПС и ОС после можданог удара може да утиче на интегритет БББ, имунофлуоресцентном анализом су извршени изрази ЗО-1, клаудина-5 и оклудина. Резултати су показали да су изрази клаудин-5, оклудин и ЗО-1 били видно смањени у групи МОД. Међутим, они су се значајно повећали након 14 дана његове администрације. Групе ПС и ОС нису показале значајне промене у експресији ових протеина (Слика 7). Ови подаци су показали да ТГ могу регулисати експресију протеина тесног споја и вероватно одржати интегритет БББ-а након И/Р повреде.

ТГ повећавају покривеност перицитом на капиларама код И/Р повређених пацова

Покривеност перицита на капиларима игра кључну улогу у одржавању интегритета БББ. Стога смо тестирали да ли се покривеност перицитима може повећати третманом ТГ, ПС и ОС. Резултати анализе интензитета имунофлуоресценције показали су да су експресије и ПДГФРб и ЦД31 драматично смањене у групи са МОД. Примена ТГ код И/Р пацова значајно је опоравила или чак повећала интензитет експресије ПДГФРб и ЦД31, али није примећена разлика у групама које су третирале ПС и ОС (Слика 8). Према томе, третман ТГ може значајно повећати покривеност перицитима. Ови налази су даље потврдили да ТГ могу одржати интегритет БББ након И/Р.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПРЕВЕНЦИЈУ ИСХЕМИЈСКОГ МОЖДА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%